VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統在兩種微生物鑒定中的運用

衛舒帆 劉靜萍

（1 昆明市食品藥品檢驗所，云南 昆明 650032；2 云南昊邦制藥有限公司，云南 昆明 650000）

近年來，微生物的檢測鑒定技術已逐步由手工檢測走向儀器化和電腦化，并力求簡便、快速、準確。由法國梅里埃公司出品的全自動微生物鑒定系統是目前世界上最先進、自動化程度最高的細菌鑒定儀器之一，已被許多國家定為細菌最終鑒定設備，并獲美國藥品食品管理局（FDA）認可。該系統有高度的特異性、敏感性和重復性，還具有操作簡便、檢測速度快的特點，絕大多數細菌的鑒定在2～18 h內可得出結果。

筆者在對藥品大腸埃希菌和大腸菌群檢測的過程中發現，部分檢測結果呈陰性的樣品，有時曙紅亞甲藍瓊脂平板上有粉紅色菌落生長，菌落周圍呈現浸潤現象，與《中國藥典》2010年版描述的大腸埃希菌的菌落形態相似。《中國藥典》2010年版對藥品中污染菌的檢測鑒定主要依靠生化實驗、血清學反應等，不能準確地檢測出該菌株的種類，而且生化實驗對于大量菌株的分類鑒定繁瑣費時、準確性差；血清學檢測成本高昂，且易產生交叉反應[1-6]。因此，尋找一種快速、準確且成本低廉的方法鑒定藥品中污染菌株是很有必要的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品：小兒復方雞內金散、六味地黃膠囊。

1.1.2 陽性對照菌液：大腸埃希菌（Escherichia coli）（CMCC（B）44102）。

1.1.3 培養基及主要試劑。pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液（生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：1212272），膽鹽乳糖培養基（生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：1301052），4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培養基（MUG，生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：121023），曙紅亞甲藍瓊脂培養基（生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：121123），乳糖膽鹽發酵培養基（生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：121112），營養瓊脂培養基（生產廠家：北京三藥科技開發有限公司，批號：1303262），95%乙醇及其他試劑均為國產分析純。革蘭陰性細菌鑒定卡（生產廠家：美國BioMerieux?Inc，批號：241267940）。

1.1.4 主要儀器：VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統，法國梅里埃；DM500光學顯微鏡，德國Leica；BHC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州金凈凈化設備科技有限公司；L600臺式低速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；BSP-150生化培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌：實驗所需培養皿、刻度吸管、量筒置于電熱恒溫培養箱中180 ℃滅菌2 h后備用。以上幾種培養基按照要求配制，置于立式壓力蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min，冷卻后備用。

1.2.2 供試液的制備：樣品均為水溶性固體制劑。分別取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，用勻漿儀混勻，作為1∶10濃度供試液。取1∶10濃度供試液1 mL，加入裝有9 mLpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中，混勻，即得1∶100供試液。以此類推，制得1∶1000供試液。

1.2.3 增菌培養：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養基各1瓶，各加入10 mL供試液（相當于供試品1 g），搖勻，置30～35 ℃培養箱內培養18～24 h。

1.2.4 陽性對照試驗：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養基各1瓶，各加入10 mL供試液（相當于供試品1 g），同時各加入1 mL大腸埃希菌菌液，搖勻，置30～35 ℃培養箱內培養18～24 h，作為陽性對照。

1.2.5 陰性對照試驗：取體積100 mL/瓶的膽鹽乳糖培養基各1瓶，各加入10 mLpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，搖勻，置30～35 ℃培養箱內培養18～24 h，作為陰性對照。

1.2.6 大腸菌群檢查：取乳糖膽鹽發酵管各3支，分別加入1∶10稀釋的供試液1 mL（含供試品0.1g）、1∶100稀釋的供試液1 mL（含供試品0.01g）、1∶1000稀釋的供試液1 mL（含供試品0.001 g）。另取1支乳糖膽鹽發酵管，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑1 mL作為陰性對照。置30～35 ℃培養箱內培養18～24 h。

1.2.7 觀察：兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液中均有產氣發酵現象，小兒復方雞內金散的增菌液表面有一層白色菌膜。小兒復方雞內金散的乳糖膽鹽發酵管有菌生長但不產酸產氣。六味地黃膠囊的1∶10濃度的乳糖膽鹽發酵管有菌生長且產酸產氣。

1.2.8 接種：分別取兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液、陽性對照液、陰性對照液各0.2 mL，接種至含5 mL MUG培養基的試管內，搖勻。同時用滅菌接種環各挑取一環兩個樣品的膽鹽乳糖增菌液及六味地黃膠囊的1∶10濃度的乳糖膽鹽發酵管培養液、陽性對照液、陰性對照液，分別劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂培養基平板上。將MUG試管和曙紅亞甲藍瓊脂培養基平板置于30～35 ℃培養箱內培養。

1.2.9 4-甲基傘形酮葡萄糖苷酸（MUG）試驗和靛基質試驗：根據《中國藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢ C微生物限度檢查法中，兩份樣品均未檢出大腸埃希菌。

1.2.10 觀察曙紅亞甲藍瓊脂平板：曙紅亞甲藍瓊脂平板于30～35 ℃培養24 h后，取出觀察。可見：小兒復方雞內金散的曙紅亞甲藍瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈粉紅色，不透明，無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，表面光滑、濕潤，但是無金屬光澤。六味地黃膠囊的曙紅亞甲藍瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈粉紅色，呈半透明狀，無明顯暗色中心，圓形，稍凸起，表面光滑、濕潤，無金屬光澤。陽性對照的曙紅亞甲藍瓊脂平板上有菌落生長。菌落呈紫黑色，菌落中心呈深紫色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，有金屬光澤。

1.2.11 分離培養：用滅菌接種環分別挑取曙紅亞甲藍瓊脂平板上的典型菌落，劃線接種于營養瓊脂斜面上，置30～35 ℃培養箱內培養18～24 h。

1.2.12 革蘭染色、鏡檢。小兒復方雞內金散中的菌體特征為：革蘭染色呈陰性，直桿狀，周生鞭毛，常成對存在。六味地黃膠囊中的菌體特征為革蘭陰性短桿菌，有鞭毛，常成對存在。

1.2.13 用VITEK Ⅱ全自動微生物鑒定系統進行鑒定：根據革蘭染色、鏡檢的結果，從兩個樣品中檢出的菌落均為革蘭陰性桿菌，故選擇革蘭陰性桿菌鑒定卡。

2 結果與分析

2.1 根據鑒定報告，小兒復方雞內金散中的污染菌的拉丁名為Pantoea spp，查VITEK 2 GN 鑒定細菌目錄，中文名為泛菌屬；六味地黃膠囊中的污染菌的拉丁名為Escherichia vulneris，查VITEK 2 GN 鑒定細菌目錄，中文名為傷口埃希菌。

2.2 泛菌屬為兼性厭氧，具有代謝和發酵類型的化能異養菌。分離自植物表面、種子、土壤和水，也可從動物和人的傷口、血和尿中分離到。

傷口埃希菌屬于埃希菌屬的一種。埃希菌屬除大腸埃希菌外，新近發現有大腸埃希菌（E.coli）、蟑螂埃希菌（E.blattae）、弗格森埃希菌（E.fergusonii）、赫爾曼埃希菌（E.hermanii）、傷口埃希菌（E.vulneris）和低活性埃希菌（E.coli inactive）。中國藥典以大腸埃希菌和大腸菌群作為藥品糞便污染的指示菌。

以上兩類菌都屬于條件致病菌，在一定條件下，如機體抵抗力下降、寄居部位發生改變或腸道菌群失調時能引起機會感染或二重感染。

3 結 論

經鑒定，兩種污染菌分別為泛菌屬和傷口埃希菌，均為條件致病菌。這兩種細菌在藥品檢驗過程中出現頻率較高，應當在藥品生產儲存過程中加以重視。VITEKⅡ全自動微生物鑒定系統能夠在較短的時間內，準確鑒定出污染菌的種類，成本低廉、方便快速，具有很高的實用性，對藥品微生物限度檢測具有重要的意義。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典,2010年版,一部,附錄ⅩⅢC[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

[2] 中國藥品檢驗標準操作規范,2010年版[S].北京:中國醫藥科技出版社,2010:351-407.

[3] 蘇德模,馬緒榮.藥品微生物學檢驗技術[M].北京:華齡出版社,2007:317-340.

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[6] 李衛娟,焦豫良,呂明生,等.一株產右旋糖苷酶海洋細菌的篩選鑒定[J].微生物學通報,2013,40(5):756-765.