綠原酸在腦膠質瘤治療中的應用前景*

楊靖怡 楊守博 康莊 康勛 綜述 李文斌 審校

腦膠質瘤是中樞神經系統最為常見且預后較差的原發性惡性腫瘤，占美國腦腫瘤注冊中心統計所有腦和中樞神經系統腫瘤的31%，占惡性腦腫瘤和中樞神經系統惡性腫瘤的81%，每年發病率為5/100 000例，且呈逐年遞增趨勢［1］。低級別膠質瘤（WHOⅠ、Ⅱ級）的中位生存時間為5～8年；高級別膠質瘤（WHOⅢ、Ⅳ級）稱為惡性膠質瘤，其中Ⅲ級間變型星形細胞瘤的中位生存時間為3年左右，Ⅳ級膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的中位生存時間僅為14.4個月［2］，年齡＞60歲的患者生存時間更短。分子病因學顯示，其發生和發展與多種因素有關［3］，包括原癌基因活化、抑癌基因失活、凋亡相關基因異常、血管活性因子高表達、相關信號轉導通路的激活等。膠質瘤作為常見的原發性顱內腫瘤，呈浸潤生長且血管豐富，其組織學異質性使得影像學及術中觀察很難明確腫瘤范圍，無法進行徹底切除［4］。目前，國際上常規應用手術輔以放療、化療綜合治療方案，以及靶向治療如貝伐單抗等藥物的使用，但患者的生存質量及預后并不理想。因此，尋找新型抗膠質瘤藥物成為近年國內外研究的熱點。

綠原酸（chlorogenic acid，CGA）是由反式肉桂酸（trans-cinnamic acids）與奎尼酸（quinic acid）組成的多酚類化合物［5］，包括香豆酰奎尼酸、阿魏?？崴?、咖啡酰奎尼酸（caffeoyl quinic acid，CQA）等分子結構，且存在多種同分異構體如新綠原酸（cryptochloro?genic acid，4-CQA）、隱綠原酸（neochlorogenic acid，5-CQA）等，目前仍沿用國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）之前的建議將3-CQA作為綠原酸［6］。綠原酸廣泛存在于杜仲、金銀花等植物中，作為一種中藥提取物，其抗腫瘤作用及分子機制已得到很多實驗證實，被認為是癌癥的有效化學防護劑［7］。本文將重點歸納綠原酸類物質抗腫瘤作用，尤其是與膠質瘤相關的分子作用機制，并介紹其在膠質瘤治療中的相關應用及前景。

1 抗膠質瘤分子機制

1.1 調節免疫功能

腫瘤微環境中的免疫系統對腫瘤的形成起到了至關重要的作用，從免疫監視到免疫平衡最終免疫逃逸，腫瘤細胞和微環境的免疫能力此消彼長。Kang等［8］通過表達譜芯片研究綠原酸對于BALB/c EMT-6雌性小鼠的作用，發現與免疫系統調節通路相關的基因CaN和NFAT基因被激活，CaN/NFAT信號通路作用廣泛，可以提高Th1型細胞因子（IFN-γ和IL-2）的表達，抑制Th2型細胞因子（IL-4和IL-10）表達，活化T細胞、巨噬細胞、NK細胞和B細胞，從而達到調節免疫作用。

微環境中細胞因子的作用可使巨噬細胞分化成不同狀態，M2型巨噬細胞表達多與高級別膠質瘤的不良預后相關，且可能促進腫瘤微環境的形成［9］，而M2型巨噬細胞向M1型轉化能夠促進抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤細胞的生長和轉移，上述現象在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤中均有發現［10］，且與非小細胞肺癌患者生存期延長相關［11］。近期研究表明綠原酸可以通過促進STAT1活化，增加LPS/IFN-γ介導的M1型巨噬細胞相關標記物如iNOS、MHCⅡ和CD11c，同時通過抑制STAT6減少IL-4介導的M2型巨噬細胞標記物Arg和CD206的表達，從而抑制膠質瘤細胞的生長。此外，綠原酸處理的G422小鼠體內CD11c陽性的M1型巨噬細胞比例增加、M2型巨噬細胞減少，其程度與荷瘤小鼠的腫瘤減少重量相一致［12］。

1.2 調節細胞周期且促進細胞凋亡

細胞凋亡的調控包括腫瘤抑制蛋白p53、視網膜細胞瘤（retinoblastoma，RB）蛋白以及Bcl-2蛋白家族成員，惡性膠質瘤細胞中存在這些基因表達的改變，其中以p53的改變最為廣泛［13］。p53蛋白是細胞凋亡調控的關鍵，可使細胞分裂周期靜止來促進受損DNA修復，并啟動DNA片段化誘導細胞凋亡以防止異常增殖［14］，其生物效應表現為Bax或Bcl-2目標基因的轉錄調控，而Bcl-2蛋白家族按其功能分為抑制凋亡和促進凋亡兩類，其中Bax作為細胞凋亡的促進基因，其過度表達可以使細胞趨于凋亡。Sitarek等［15］分析發現益母草根莖提取物成分中含有綠原酸，將膠質瘤細胞經益母草根莖提取物處理后，流式細胞計數分析發現膠質瘤細胞凋亡增加且呈劑量依賴性，進一步檢測凋亡相關基因表達可見p53表達水平上調，同時存在Bcl-2蛋白表達降低以及Bax蛋白水平的顯著提高，而Bax/Bcl-2的比例升高更傾向于促進膠質瘤細胞凋亡。由此可見，綠原酸可能增加p53表達，促進損傷DNA的修復，同時上調Bax/Bcl-2比例，介導膠質瘤細胞的凋亡。此外，上述細胞凋亡過程可以避免炎癥反應發生及其引起的周圍細胞損傷，所以綠原酸抗腫瘤作用的同時無明顯不良反應。

1.3 調節代謝并抑制腫瘤細胞侵襲和轉移能力

侵襲性和遠處轉移是惡性腫瘤細胞的本質特性和基本能力，而腫瘤細胞的侵襲能力主要通過基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）降解、破壞細胞外基質和基底膜得以實現。MMP-2作為蛋白溶解酶家族成員，被證實在腫瘤增殖、侵襲過程中扮演重要角色。惡性腫瘤利用葡萄糖的速率高于正常組織，這與其惡性程度及治療抵抗、不良預后相關。

Belkaid等［16］發現U87膠質瘤細胞高表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PT）mRNA，后者在膠質瘤細胞中可以使葡萄糖在非糖異生組織如腦組織中分解代謝，并調控細胞內信號通路以及侵襲性腫瘤細胞的表型。綠原酸可抑制G6PT活性，阻礙細胞糖酵解途徑，使細胞內ATP水平降低，降低MMP-2分泌，從而抑制腫瘤生長、侵襲［17］。此外，綠原酸可通過MT1-MMP/G6PT信號軸抑制S-1-P介導的ERK途徑磷酸化［18］，而1-磷脂-神經鞘氨醇（1-phospholipid-sphin?gosine，S-1-P）可以有效促進GBM細胞分裂，并通過動員細胞內鈣離子誘導細胞外信號調節蛋白磷酸化，引起細胞侵襲和轉移。綜上，抑制G6PT可以有效地影響腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，尤其對于高表達G6PT mRNA的惡性腫瘤。作為腫瘤細胞信號通路研究中的新角色，G6PT在腫瘤發生發展過程中的地位以及綠原酸抗膠質瘤細胞的具體作用機制仍值得深入研究。

1.4 抑制腫瘤血管再生

血管生成是腫瘤發展過程中的關鍵，腫瘤缺氧微環境可經促血管生成因子誘導血管再生，其中缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在缺氧細胞的應答中起重要作用［19］，涉及腫瘤血管生成過程中許多基因的轉錄激活。研究表明，綠原酸在低氧條件下可抑制HIF-1α蛋白的表達和功能活性，并有效抑制下游血管內皮生長因子（vascu?lar endothelial growth factor，VEGF）表達及其介導的蛋白激酶（AKT）磷酸化過程，從而影響內皮細胞遷移管樣結構形成等，最終抑制血管生成。由此可見，綠原酸可以通過下調HIF-1α/AKT途徑抑制低氧環境誘導的血管生成［20］，抑制腫瘤增殖。

近年來，綠原酸及其抗腫瘤分子機制得到了廣泛而深入的研究，除上述在膠質瘤細胞中的作用外，對于其他腫瘤的相關作用機制研究也多有報道。如綠原酸在白血病細胞中可以通過線粒體膜電位改變、氧自由基（ROS）的產生、Caspase誘導活化促進腫瘤細胞凋亡［21］；近期研究發現綠原酸可干擾人乳腺癌MCF-7細胞周期，阻滯G1期腫瘤細胞并減少S期細胞數，其抗腫瘤作用呈劑量依賴性，IC50值為（52.5±4.72）μg/mL［22］；此外，綠原酸可介導甲基化沉默基因啟動子中的CpG島去甲基化，從而恢復腫瘤細胞中沉默的抑癌基因，表現出抑制DNA甲基化，影響腫瘤細胞表觀遺傳學的作用［23］。

綜上所述，綠原酸抗腫瘤機制不同于傳統化療或靶向等藥物，包括抗氧化應激、影響腫瘤細胞的侵襲和遠處轉移能力、調節免疫系統、干擾細胞周期、抑制血管生成等多重作用，故其交叉耐藥可能性低，且有望在臨床應用中實現逆轉現有抗腫瘤藥物的多重耐藥性［24］。

2 與傳統化療協同作用

由于腫瘤分子病因機制的復雜性，新型化療藥物及多種藥物聯合方案仍無法有效改善化療過程中腫瘤對藥物的耐受性，從而導致治療失敗甚至患者死亡，故如何干預、改善腫瘤耐藥方式是腫瘤治療領域的熱點及重點。

在宮頸癌A431細胞系中，一定濃度的綠原酸可增加順鉑及奧沙利鉑的活性，從而實現協同抗腫瘤作用，經高效液相色譜法分析表明綠原酸在一定濃度時可與順鉑及奧沙利鉑形成更有活性的化合物［25］；MMTV-PyVT自發乳腺癌小鼠實驗中，拉帕替尼與綠原酸合用有效抑制了乳腺癌的肺轉移，這可能與抑制M2型巨噬細胞極化相關［26］。近期研究表明，綠原酸可以增強5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）誘導的肝癌細胞增殖抑制，綠原酸和5-FU的協同作用可能是由于綠原酸誘導的ROS過量產生而使ERK失活［27］，表明綠原酸在肝癌細胞中是5-FU化學療法的潛在化學增敏劑。

由此可見，在動物實驗中綠原酸對多種傳統化療藥物均有協同作用，聯合用藥可通過調節信號通路、參與免疫調節等多種途徑提高抑瘤率，降低腫瘤耐藥機制，改善現有藥物的治療效果。此外，綠原酸應用于人體或動物實驗模型中尚未發現嚴重不良反應，安全性較高，這些特點均為目前臨床治療提供了有利條件，值得深入研究其抗腫瘤價值。

3 綠原酸在人體內代謝的相關研究

藥物在人體內代謝及藥效動力學的研究對于最大限度發揮藥物效果起著重要作用，已有學者進行了綠原酸以不同給藥方式在人體內代謝的相關探索。

人體實驗模型表明，口服綠原酸約三分之一在小腸中以原型被吸收，其余進入大腸經微生物代謝分解后吸收［28］，而腸道微生物群落會影響其生物利用度［29］。近期，北京世紀壇醫院正在進行綠原酸肌肉注射劑安全性、耐受性和藥物代謝動力學特征研究的Ⅰ期臨床試驗，Ren等［30］分析受試者尿液標本中含有6種代謝物，其中以未代謝的綠原酸及3'-甲基-5-CQA（M3）和4'-甲基-5-CQA（M4）為主，通過反向分子對接分析M3、M4及綠原酸共同作用于RAC絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和DNA復制，且三者均與惡性膠質瘤相關的不同靶點存在相互作用，雖然其具體作用機制尚待明確，但該研究首次闡明了綠原酸代謝產物在治療惡性膠質瘤中可能存在活性，有助于進行針對性研究并促進綠原酸在治療惡性膠質瘤領域的應用。

4 結語

膠質瘤是原發于中樞神經系統的腫瘤，其中膠質母細胞瘤患者的生存期很短，預后極差，同時其發生、發展機制十分復雜，傳統的臨床治療手段局限且效果欠佳，患者的生存期及生存質量并不理想。近年來，植物提取物綠原酸作為新型抗腫瘤藥物受到廣泛關注，其抗腫瘤分子機制多樣，可通過多種通路及途徑實現，且對于乳腺癌、結腸癌等多系統腫瘤有效，作用范圍廣泛。雖然已有文獻報道綠原酸影響腦膠質瘤細胞的增殖和轉移、調節免疫系統、協同傳統化療改善療效等作用，但是目前對于綠原酸抗腦膠質瘤的具體作用機制、聯合用藥方式及劑量、體內藥物代謝等方面的研究尚不成熟，難以用于臨床給藥，故深入研究綠原酸對于膠質瘤細胞作用的分子機制對于尋找新的抗腫瘤作用靶點、探索藥物臨床新用途，進而開發利用綠原酸具有重要科學及臨床意義。

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