三醇皂苷中人參皂苷Rg1的分離純化工藝研究

李瀅 張敏 高宏濤

摘要：目的 優選三醇皂苷中高純度人參皂苷Rg1的中壓制備工藝條件。方法 采用反相C18色譜中壓制備方法，以人參皂苷Rg1的純度及收率為指標進行考察。結果 C18色譜柱徑高比為1：3.25，以20%乙醇上樣0.2倍柱體積的三醇皂苷、以8 BV/h 的洗脫流速用30%、30%-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，干燥得人參皂苷Rg1精品。結論 經純化后可以從三醇皂苷中分離得到純度高于99.5%的人參皂苷Rg1。本文首次提供了純度高于99.5%的人參皂苷Rg1的中壓制備工藝，經多次試驗驗證該工藝穩定可行且重復性好，可用于工業化放大生產。

關鍵詞：三醇皂苷；人參皂苷Rg1；純化工藝

中圖分類號：R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）11-0069-03

【Abstract】Objective： To optimize the medium pressure preparation process conditions of high purity ginsenoside Rg1 in triol saponins. Methods： The reversed-phase C18 chromatographic preparation method was used to investigate the purity and yield of ginsenoside Rg1. Results： The diameter-to-height ratio of C18 column was 1：3.25. The triol saponin of 0.2 times column volume loaded with 20% ethanol and the elution flow rate with 30%， 30%-40%， 40% ethanol were separately eluted to 1， 3， 0.5 column volumes at 8 BV/h. The crude ginsenoside Rg1 was concentrated and dissolved in 4 volumes of 95% ethanol. Then， 0.5% activated carbon was heated and refluxed for 40 min， and dried to obtain good quality higinsenoside Rg1. Conclusion： After purification， ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% can be isolated from triol saponin. This medium-pressure preparation process of ginsenoside Rg1 with purity higher than 99.5% is provided for the first time. It has been proved by many experiments that the process is stable， feasible and reproducible， and can be used for industrial scale-up production.

【Key words】triol saponin， ginsenoside Rg1， purification process

三七為五加科植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen 的干燥根和根莖，由于其具有顯著的止血化瘀作用，三七及其提取物在心腦血管治療及預防方面均在國際市場占有一席之地。皂苷是三七的主要有效成分之一，研究表明，人參皂苷Rg1占三七總皂苷量的20%，且具有抗焦慮、抗癲癇[1]、改善阿爾茲海默癥認知能力[2]、減少缺血性/再灌注心律失常的發生率及心肌梗死面積[3]、治療肌萎縮等藥理作用[4]，這使其在防治心腦血管疾病方面具有極大的潛在臨床應用價值。本試驗采用單因素多水平試驗，以人參皂苷Rg1的純度及收率為指標，優選出了人參皂苷Rg1的最佳反相（C18硅膠色譜）中壓制備工藝條件。本研究提供了純度高于99.5%的人參皂苷Rg1純化工藝，為人參皂苷Rg1的進一步研究開發提供了物質基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 美國戴安U3000型高效液相色譜儀；梅特勒XP-205 型分析天平；Ulupure 超純水制備系統（成都超純）；日本山善株式會社YFLC-AI-700中低壓制備色譜。

1.2 材料 人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201529）中國食品藥品檢定研究院；三醇皂苷（批號：2015003）昆藥集團股份有限公司藥物研究院自制；C18反相硅膠（蘇州納微科技有限公司）；安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司）；甲醇、乙醇為分析純；全部實驗用水均為超純水制造系統制備的電阻率大于 18.25 MΩ·cm的超純水。

2 方法與結果

2.1 人參皂苷Rg1含量測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定三七總皂苷對照提取物適量，加70%甲醇溶液制成每1 mL含2.5 mg的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品25 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：安捷倫Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動相：以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表1中的規定進行梯度洗脫；流速：1.5 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl；理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6000。

2.2 三醇皂苷中人參皂苷Rg1的分離

2.2.1 人參皂苷Rg1純化條件的篩選 取反相C18色譜柱（50 μm，20*250 mm），采用中低壓制備色譜儀，考察乙醇濃度在20-45%之間梯度洗脫所得有效成分人參皂苷Rg1的純度及收率。分別上樣2 g三醇皂苷（人參皂苷Rg1含量：1.12 mg/mL），洗脫梯度如下表2～5，結果見表6。

從試驗結果可知，條件2洗脫所得人參皂苷Rg1純度最高，但收率較低，僅有76.70%；條件4洗脫所得人參皂苷Rg1收率最大，且純度較高為89.88%，與條件2洗脫最高純度90.25%相差不大，因此選擇條件4作為最適洗脫條件。

2.2.2 上樣量的選擇 取反相C18色譜柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），分別上樣2（0.1 BV）、3（0.15 BV）、4（0.2 BV）g，以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個柱體積，檢測洗脫液中人參皂苷Rg1的純度，篩選出最優上樣量。結果見表7。

根據上述試驗結果可以看出，當上樣4（0.2 BV）g時，分離得到的人參皂苷Rg1的純度及收率均最高，因此選擇上樣4（0.2 BV）g為最適上樣量。

2.2.3 洗脫流速的選擇 取反相C18色譜柱（50 μm，20*65 mm，20 mL），上樣4（0.2 BV）g，以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個柱體積，洗脫流速分別為6、7、8 BV/h。測定洗脫液中人參皂苷Rg1的純度，結果見表8。

試驗結果顯示，隨著洗脫流速的增加，洗脫液中人參皂苷Rg1的純度不斷降低，但收率不斷升高，洗脫流速8 BV/h所得人參皂苷Rg1收率最高，且純度較7 BV/h洗脫所得相差不大，因此選擇洗脫流速8 BV/h作為最適洗脫流速。

2.2.4 精制條件的篩選 通過之前的試驗可以獲得純度為90%左右的人參皂苷Rg1粗品，擬采用活性炭精制的方法以獲得純度高于99%的人參皂苷Rg1。

2.2.4.1 溶劑倍數的選擇 取100 mL三角瓶4個，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，之后分別加入20、30、40、50 mL的95%乙醇，60 ℃水浴溶解，記錄溶解所需時間，見有9。

從上述試驗結果可以看出，20 mL（4倍體積）95%乙醇溶解人參皂苷Rg1粗品用時最短，因此選擇4倍95%乙醇作為最優溶解溶劑。

2.2.4.2 加活性炭量的選擇 取100 mL三角瓶3個，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍體積）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，之后分別加入0.3%、0.5%、1%的活性炭，70 ℃水浴回流30 min，趁熱過濾，濾液減壓回收溶劑，測定人參皂苷Rg1純度，見表10。

從上表可以看出，選取人參皂苷Rg1純度及收率最高的實驗條件，即加活性炭0.5%為最優加活性炭的量。

2.2.4.3 回流時間的選擇 取100 mL三角瓶5個，各加入5 g的人參皂苷Rg1粗品，加入20 mL（4倍體積）95%乙醇，60 ℃水浴溶解，加入0.5%活性炭，70 ℃水浴分別回流10、20、30、40、60 min，趁熱過濾，濾液減壓回收溶劑，測定人參皂苷Rg1純度，見表11。

從表中可以看出，回流60 min所得人參皂苷Rg1純度及收率均最高，但與回流40 min所得人參皂苷Rg1純度及收率相比相差不大，且節約了時間，降低了生產成本，因此選取回流40 min為最優條件。

2.3 工藝驗證試驗 取反相C18色譜柱（200 mL，徑高比為1：3.25）上樣40 g（0.2 BV），之后以20%乙醇上樣、以8 BV/h 的洗脫流速用30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，得人參皂苷Rg1精品，測量其純度。結果見表12。

試驗結果表明，該純化工藝可以將三醇皂苷中的色素及Rb1有效剔除，通過精制工藝之后得到的人參皂苷Rg1純度在99.5%以上，且轉移率大于90%，表明該工藝穩定可行。

3 討論

本研究首次提供了純度99.5%以上的人參皂苷Rg1的分離純化工藝。通過對比不同工藝參數，以人參皂苷Rg1的純度及轉移率為標準，確定了人參皂苷Rg1反相C18色譜中壓制備純化工藝條件為：反相C18色譜柱徑高比為1：3.25，以20%乙醇上樣、以8 BV/h 的洗脫流速以20%乙醇上樣、30%、30-40%、40%乙醇分別洗脫1、3、0.5個柱體積，濃縮得人參皂苷Rg1粗品，加入4倍體積的95%乙醇溶解，之后加入0.5%的活性炭熱回流40 min，得人參皂苷Rg1精品。

經驗證，采用C18色譜中壓制備分離純化技術，可有效從三醇皂苷中分離得到純度高于99.5%的人參皂苷Rg1，該工藝條件及參數可行且重復性好，可用于進一步的工業化生產，為其進一步研究提供了物質基礎，也為其臨床用藥價值提供了技術支持。

參考文獻：

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