健脾益腎、祛瘀化濁法對糖尿病腎病大鼠腎臟保護作用的研究

曹擁軍 徐作俊 陳亞琴

摘要：目的 探討健脾益腎、祛瘀化濁法對糖尿病腎?。―N）大鼠腎臟的保護作用及機制。方法 鏈脲佐菌素（STZ）誘導糖尿病腎病大鼠模型，隨機分為降糖精低劑量組、降糖精中劑量組、降糖精高劑量組，ACEI組（陽性對照治療組）各16只，另以16只正常大鼠作為正常組。降糖精顆粒低、中、高劑量組分別灌胃給予降糖精顆粒9 g（生藥量）/kg，18 g（生藥量）/kg和36 g（生藥量）/kg，1次/天；ACEI組給予貝那普利（1 mg/kg·d-1）灌胃，糖尿病腎病模型組及正常組給予0.9%NaCl溶液灌胃。共觀察8周，檢測各組8周末24h尿微量白蛋白定量、腎重/體重、腎功能（Scr、BUN），免疫組織學檢測。結果 與正常對照組比較，模型組大鼠血糖明顯升高（P<0.05），體質量明顯下降（P<0.05），腎質量、腎質量/體質量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，降糖精各劑量組及ACEI組大鼠空腹血糖明顯降低（P<0.05），體質量明顯高增加（P<0.05），腎質量、腎質量/體質量明顯降低（P0.05）。與正常對照組比較，模型組大鼠UAER、BUN 和Scr水平均明顯增高，差異有統計學意義（P0.05）。由Western blot結果看出，模型組大鼠腎組織CTGF和VEGF含量高于正常組；降糖精各劑量組及ACEI組大鼠腎組織CTGF和VEGF含量均低于模型組；降糖精劑量升高，CTGF和VEGF表達降低。結論 健脾益腎、祛瘀化濁法能明顯改善大鼠腎臟功能，其機制可能與抑制CTGF、VEGF的表達有關。

關鍵詞：糖尿病腎??；降糖精顆粒；大鼠；健脾益腎、祛瘀化濁法

中圖分類號：R285.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）11-0066-03

【Abstract】Objective： To study the protective effect and mechanism of spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method on kidney in diabetic nephropathy （DN） rats. Methods： Rat models of diabetic nephropathy induced by streptozotocin （STZ） were randomly divided into low， medium and high dose groups of Jiangtangjing granules， and ACEI group （positive control group）， 16 rats per group. Another 16 normal rats were used as the normal group. The low， medium and high doses of Jiangtangjing granule groups were administered intragastrically with granules 9 g （raw dose）/kg， 18 g （raw dose）/kg and 36g （raw dose）/kg， once a day. The ACEI group was administered with benazepril （1 mg/kg·d-1）， and the diabetic nephropathy model group and the normal group were administered with 0.9% NaCl solution. The observation lasted 8 weeks. The 24-hour urine microalbumin quantitation， kidney weight/body weight， renal function （Scr， BUN） of each group were detected by immunohistochemistry at the end of the 8th week. Results： Compared with that of the normal control group， the blood glucose of the model group significantly increased （P0.05）. Compared with that of the normal control group， the levels of UAER， BUN and Scr of the model group significantly increased， and the difference was statistically significant （P0.05）. The results of Western blot showed that the levels of CTGF and VEGF in the renal tissue of the model group were higher than those in the normal group. The contents of CTGF and VEGF in the renal tissue of the Jiangtangjing groups and the ACEI group were lower than those in the model group. With the increase of Jiangtangjing doses， the expression of CTGF and VEGF deceased. Conclusion： The spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method can improve the kidney function of rats， and its mechanism may be related to the inhibition of CTGF and VEGF expression.

【Key words】diabetic nephropathy， Jiangtangjing granules， rats， spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method

糖尿病腎病又稱糖尿病腎小球硬化癥，是糖尿病最常見的、嚴重的慢性微血管并發癥，是糖尿病致死致殘的主要原因之一。在西方國家已成為終末期腎?。‥SRD）的第一位因素[1]。國內，約55%的DM患者尿檢尿蛋白陽性，當患者出現臨床蛋白尿約7年內有50%進入終末期腎?。‥SRD），大多數患者最終將不可避免的需要行腎透析和腎移植治療[2]。因此探求DN的發病機制，尋找有效防治并逆轉DN進展的藥物，已經成為一個迫在眉睫的社會問題。迄今，尚無有效西藥能阻止糖尿病腎病腎功能損害的自然進程，而近年來，中醫藥在防治糖尿病及其并發癥方面，雖不具系統性，但已顯示出獨特的優勢，在延緩病情進展及控制疾病的惡化等方面，取得了較為滿意的結果。因而中醫藥對糖尿病腎病的治療蘊含了廣闊的前景。降糖精顆粒為南通市中醫院院內制劑，其臨床用于防治早中期糖尿病腎病已有多年，且取得了較好療效。在已有臨床研究的基礎上，我們通過制備糖尿病腎病實驗大鼠模型，觀察降糖精顆粒對糖尿病腎病大鼠影響，驗證其療效及探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠，雌雄兼用，體質量180-220 g，由昆明醫學院動物試驗中心提供，許可證號為SCXK（滇）2014—0014。

1.1.2 藥物 降糖精顆粒由南通市中醫院制劑中心生產，10 g/袋，（批準文號：蘇藥制字Z04001366）；鹽酸貝那普利購自北京諾華制藥公司，5 mg/片，（批準文號：X0305）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與造模 健康SD大鼠，適應性喂養一周后，腹腔一次性注射鏈脲佐菌素（50 mg/kg體重），48 h后尾靜脈采血，用快速血糖儀測定全血血糖，血糖>16.7 mmol/L者確定為糖尿病模型成功；隨機分為病理模型組，陽性藥組，降糖精顆粒低、中、高劑量劑量組，另設一組為正常對照組，每組16只。

1.2.2 給藥方法 病理模型組和陽性藥組分別以生理鹽水和貝那普利組（1 mg/kg·d-1）灌胃，降糖精顆粒低、中、高劑量組分別灌胃給予降糖精顆粒9 g（生藥量）/kg，18 g（生藥量）/kg和36 g（生藥量）/kg，1次/天，給藥量按照實驗動物與人用藥量的換算公式計算得出。持續8周。

1.2.3 標本收集 灌胃給藥的第4和第8周分別處死8只大鼠。處死前心臟穿刺取血標本，血清測血肌酐、總蛋白、白蛋白等。取左、右腎組織，左腎組織以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋；右腎組織液氮冷凍，-80℃保存。

1.2.4 腎臟指數計算 腎臟指數（RI）=左腎質量（LRW）/大鼠體質量（BW）×100。

1.2.5 腎功能測定 血清尿素氮（BUN）、肌酐（Ccr）、尿酸（UA）采用7060Hitachi 全自動生化分析儀測定。

1.2.6 尿白蛋白含量測定 采用放射免疫法測定。

1.2.7 Western blot 取適量腎組織，加入細胞裂解液（RIPA：PMSF：蛋白酶抑制劑：磷酸酶抑制劑=100：1：1：1）并勻漿，離心后取上清作為蛋白提取液。通過Western blot法對蛋白提取液進行凝膠電泳，將蛋白轉印至PVDF膜上，分別孵育CTGF、VEGF和GAPDH一抗及二抗，化學發光法顯色，觀察條帶；Western blot由云南省中醫醫院中心實驗室完成。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行統計學處理。均數比較采用方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀況 實驗期間正常組大鼠體質量增加明顯，毛澤光滑，精神狀態良好，反應靈敏，動作自如。模型建立成功后，模型組大鼠逐漸出現多飲、多尿、多食、消瘦以及反應遲鈍、毛發枯黃、尾巴蒼白濕冷、精神萎靡等現象。用藥4周后，降糖精各劑量及ACEI組大鼠精神、進食量、飲水量、尿量有所改善；用藥8周后上述現象逐漸恢復正常，與模型組大鼠比較毛色明顯轉好，體質量增加，自主活動亦明顯改善。

2.2 各組大鼠血糖、體質量、腎質量和腎質量/體質量 與正常對照組比較，模型組大鼠血糖明顯升高（P<0.05），體質量明顯下降（P<0.05），腎質量、腎質量/體質量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，降糖精各劑量組及ACEI組大鼠空腹血糖明顯降低（P<0.05），體質量明顯高增加（P<0.05），腎質量、腎質量/體質量明顯降低（P0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠UAER、BUN 和Scr水平 與正常對照組比較，模型組大鼠UAER、BUN 和Scr水平均明顯增高，差異有統計學意義（P0.05）。見表2。

2.4 各組大鼠腎組織CTGF和VEGF的表達 由Western blot結果看出，模型組大鼠腎組織CTGF和VEGF含量高于正常組；降糖精各劑量組及ACEI組大鼠腎組織CTGF和VEGF含量均低于模型組；降糖精劑量升高，CTGF和VEGF表達降低。見圖1。

3 討論

糖尿病腎病的發病機制十分復雜，目前尚未完全闡明，但一致認為其發病是由遺傳因素和環境因素共同作用的結果。CTGF和VEGF在糖尿病腎病發生發展過程中起著重要作用。CTGF是腎臟纖維化過程中的重要調節因子。有人腎活檢標本中CTGF表達顯著增高。尤其是腎小球實質細胞，包括腎小球系膜細胞，其升高程度與腎小球硬化呈相關性[3]。由此看來，CTGF在糖尿病腎病的發生發展中有重要作用。VEGF是目前所知的最強的血管通透性因子，與腎小球基底膜（GBM）有很高的親和力，能引起GBM通透性增加，改變腎臟血流動力學而導致蛋白尿。VEGF參與早期糖尿病腎病的發病機制，VEGF可促進系膜細胞（MC）合成細胞外基質（ECM）。最近的研究顯示糖尿病腎病的發生和VEGF在腎組織高表達有關，DM持續的高血糖狀態對VEGF表達具有上調作用，機制可能是高糖引起細胞缺氧致VEGF表達上調，已知缺氧是VEGF最強的刺激因素。

古代醫家對糖尿病腎病早就有認識，根據臨床表現不同的癥狀，分屬中醫“消渴”、“水腫”、“尿濁”、“癃閉”、“虛勞”、“溺毒”等范疇。中醫文獻中雖無糖尿病腎病這一名稱，但對本病的臨床表現早有記載，如《圣濟總錄》云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開合不利，水液凝聚體內而出現水腫。”明代《證治要訣》云：“三消久而小便不臭，反作甜氣，在溺中滾涌，更有浮溺面如豬脂，此精不禁，真元竭也?！敝赋隽讼嗜站貌l新癥，病情加重，致使真元竭，預后不佳。由于氣虛不能帥血而行，陽虛寒凝血滯，陰虛火旺煎灼津液，均可導致瘀血痰濁的形成。氣陰雙虧，痰濁瘀血痹阻脈絡是消渴病發生并發癥的病理基礎。糖尿病腎病為消渴日久，纏綿不愈，使臟腑功能失調，陰陽氣血虛衰而發病.，糖尿病腎病病理特點為本虛標實，虛實夾雜，虛在脾腎、實在瘀血濁毒?！毒霸廊珪?腫脹》：“凡水腫等癥，乃肺脾腎三臟相干之病，蓋水為至陰，故其本在腎，其標在肺，水唯畏土，故其制在脾?！闭f明本病初期以肺、脾、腎虛損為主，因肺、脾、腎虛損，導致濕濁毒邪內蘊，進而彌漫三焦，阻遏氣機，氣滯則血瘀，加之氣虛無力運血，終致瘀血內生?！皾岫尽焙汀伴懷边M一步加重臟腑的損害，形成正虛邪實互為因果的病因病機特點。針對病因病機，治療應以活血化淤，排毒泄濁，健脾益腎為主。故《內經》云：“治病必求于本”。所以健脾益腎，祛瘀化濁是其根本治法。降糖精顆粒是本院內分泌科經長期臨床實踐總結的治療糖尿病腎病的結晶。其方中黃芪為君，升清陽，補肺氣，布精微，為補氣升陽之要藥，氣旺則陰津得以化生，津液生則渴可止；臣以制黃精、薏苡仁、葛根清熱滋陰，生津潤燥而止渴；佐以生山楂、水蛭、白芥子祛瘀通絡；使以山藥三焦并理，能助諸藥上補肺金生津止渴、中健脾胃輸布津液，下補腎元而縮尿澀精。諸藥合用，標本兼顧，共奏健脾益腎、祛瘀化濁之功效。

總之，在糖尿病腎病大鼠模型中，降糖精顆粒對緩解腎臟損害、保護腎臟有確切的療效，其作用除與降低血糖、改善腎功能、減少尿蛋白有關外，可能還與下調CTGF、VEGF表達以防治腎臟纖維化的作用有關。

參考文獻：

[1]Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，et al.Excerpts from the United States Renal Data System 2003 Annual Data Report：atlas of end-stage renal disease in the United States.Am J Kidney Dis.2003；42（6S5）：A5-7.

[2]Lin Shanyan.Nephrology in China：A great mission and momentous challenge.Kidney int.2003；63（S83）：S108-S10.

[3]Suzuki D，Toyoda M，Umezono T，et al.Glomerular expression of connective tissue growth factor mRNA in various renal disease[J].Nephrolodgy，2003，8（2）：92-97.

（收稿日期：2018-05-24）