龍眼核多酚提取工藝優化及降膽固醇作用

李 妍， 曾亞麗， 曹珂珂， 黃世瑜， 王 娣

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是屬于無患子科龍眼屬植物，是一種典型的亞熱帶果樹[1]，其果實俗稱桂圓.近年來，相關研究表明，龍眼核多酚具有良好的抗氧化、抑菌及降血糖等生物活性[2]，并且在防治心血管疾病、降低膽固醇等方面也具有一定的作用[3].當前對龍眼核的研究重點僅著重于對龍眼淀粉、棕色素、多糖的提取測定及研究等方面，而關于龍眼核多酚的研究相對不足[4].通過大量研究結果證實，多酚多種生物活性表現在抗癌、抗菌、抗氧化和預防心腦血管疾病等方面[5].本文把龍眼核作為原料，對其中的多酚類化合物采用微波輔助萃取法提取，通過單因素實驗，運用響應面設計構建關于多酚的提取率和提取條件的數學模型，由此得出優化的提取工藝條件并測試其體外降血脂作用，以便進一步龍眼核的利用率，為龍眼核進一步深加工做準備[6-10].

1 實驗材料與設備

1.1 材料與試劑

龍眼（品種靈龍，產地廣西靈山縣），龍眼核干燥粉碎過60目篩密閉保存于棕色瓶中.

膽固醇（國藥集團化學試劑有限公司）；沒食子酸（天津市永大化學試劑有限公司）；鎢酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；鉬酸鈉（無錫市亞泰聯合化工有限公司）；硫酸鋰（天津博迪化工股份有限公司）；石油醚（天津市永大化學試劑有限公司）；液溴（天津市大茂化學試劑）.

1.2 儀器

電熱鼓風干燥箱（上海-恒科學儀器有限公司）；XFB-200高速中藥粉碎機（吉首市中誠制藥機械廠）；電子天平AB323（上海海康電子儀器廠）；JK-800DB型數控超聲清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）；數顯恒溫水浴鍋HH-1（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）.

2 實驗方法

2.1 試驗流程

龍眼核烘干、粉碎→提取→抽濾→處理濾液→測吸光度→計算提取率

2.2 沒食子酸標準曲線

準確稱取100 mg的沒食子酸，溶解于1 000 mL的容量瓶中，定容，搖勻，得到標準液濃度為0.1 mg/mL.再分別吸取上述沒食子酸標準液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL的棕色容量瓶中.分別加入FC試劑，搖勻.在0.5-8 min內，加入10%Na2CO312 mL，充分混合后，蒸餾水定容.室溫下避光放置2 h.在765 nm波長下測吸光度[11].每個樣品設置三次重復實驗，取其平均值.把沒食子酸溶液的濃度作為橫坐標，把所測的吸光度作為縱坐標，作標準曲線，可以得到線性回歸方程：y=0.10397x-0.00838，R2=0.9958.

2.3 計算公式

式中：C為樣品的濃度（根據標準曲線算出），mg/mL；

V為樣品稀釋后的體積，mL；

n為稀釋的倍數；

m為粗提取物質量，mg.

式中：A0為空白溶液膽固醇濃度，mg/mL；

A1為樣品溶液膽固醇濃度，mg/mL.

2.4 微波輔助提取龍眼核多酚的單因素試驗

2.4.1 料液比對提取率的影響

稱取2 g的龍眼核粉，取80%的乙醇濃度，時間3 min，分別在料液比 1：20、1：30、1：40、1：50、1：60 條件下提取，再按“2.2”項測定其吸光度，三次平行，提取率可根據標準曲線方程和提取率的計算公式算出.

2.4.2 時間對提取率的影響

稱取2 g的龍眼核粉，取80%的乙醇濃度，1：50的料液比，分別在提取時間為 1、2、3、4、5 min條件下提取，按“2.2”項測定吸光度，三次平行，提取率可根據標準曲線方程和提取率的計算公式算出.

2.4.3 乙醇濃度對提取率的影響

稱取2 g龍眼核粉，料液比1：30，乙醇濃度40%、50%、60%、70%、80%下提取 4 min，按“2.2”項測定吸光度，三次平行，提取率可根據標準曲線方程和提取率的計算公式算出.

2.5 響應面優化提取條件

料液比、提取時間和乙醇濃度三個因素分別對提取率的影響可通過單因素實驗的結果看出.從每個因素中選取三個水平，通過Box-Benhnken設計，目標為龍眼核多酚的提取率，實驗變量取料液比、提取時間、乙醇濃度三個因素，在此之上做響應面實驗，得到優化的提取條件.實驗因素水平編碼表如下表1.

表1 分析因子與水平編碼

2.6 驗證試驗

從響應面法實驗中分析得到的結果，由此確定最佳提取條件.為與預測值進行比較，需在最佳的提取條件下做三組平行實驗，計算出各組提取率，取其平均值.

2.7 降膽固醇試驗

2.7.1 膽固醇標準曲線

膽固醇標準曲線繪制相關文獻方法進行，略有改動[12].具體方法為：準確吸取膽固醇工作液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL分別置于10 mL試管內，加入冰乙酸，定容到4 mL，之后沿管壁加2 mL鐵礬顯色液，混勻，在15-90 min內，560 nm下測吸光度.每組平行三次，取其平均值.橫坐標為膽固醇溶液濃度，縱坐標為吸光度，作標準曲線，得到線性回歸方程：y=0.00979x-0.001，R2=0.9984.

2.7.2 降膽固醇試驗

采用實驗得出的最佳提取條件提取龍眼核多酚，分別吸取1 mL不同濃度的龍眼核多酚溶液于10 mL試管內，再依次加入（1 mL 100μg/mL膽固醇溶液+3 mL冰乙酸+2 mL鐵礬顯色液），測定吸光度，計算不同時間溶液中膽固醇的清除率[13-15].

3 結果與分析

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 提取時間對龍眼核多酚的影響

在料液比為1：50，乙醇濃度為80%的微波提取條件下，得到龍眼核多酚提取率隨時間長短變化如圖1所示，在提取時間4 min之前提取率隨著時間增大而增大，之后提取率開始下降，因此在提取時間中選擇3、4、5 min三個水平.

3.1.2 料液比對龍眼核多酚的影響

微波提取條件為乙醇濃度80%，時間3 min，得出龍眼核多酚提取率隨不同料液比的變化如圖2所示，龍眼核多酚提取率在料液比1：40之前呈上升趨勢，隨后下降.因此，在料液比選擇 1：30、1：40、1：50 三個水平.3.1.3 乙醇濃度對龍眼核多酚的影響

圖1 提取時間對龍眼核多酚的影響

圖2 料液比對龍眼核多酚的影響

微波提取條件為時間3 min，料液比1：40，得出龍眼核多酚提取率隨不同乙醇濃度變化如圖3所示，龍眼核多酚提取率先一直呈上升趨勢，之后逐漸趨于變緩.因此，在乙醇濃度上選擇60%、70%、80%三個水平.

圖3 乙醇濃度對龍眼核多酚的影響

3.2 響應面法設計及結果

3.2.1 響應值結果及其擬合模型

采用Box-Behnken設計實驗方案得到實驗設計及結果如下表2所示.

通過Design-expert試驗設計，把料液比、提取時間、乙醇濃度作為響應變量，提取率作為響應值，對表2進行回歸擬合的分析后得到擬合方程如下：Y=5.50+0.67A+0.30B+0.21C-0.073AB-0.074AC+0.044BC-0.34A2-0.43 B2-0.34C2試驗方差分析如下表3所示.

由表3顯示，模型的F值為18.53，得出因變量與自變量之間的線性關系較明顯，模型的失擬項不顯著，說明模型與試驗的擬合情況良好.之后用Box-Behnken繼續分析并結合實際操作得到料液比1：40，乙醇濃度65%，提取時間3 min為最佳提取條件，得出龍眼核多酚預測提取率為6.09%.

表2 試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析

3.2.2 等高線圖和響應曲面圖分析

當3min作為提取時間固定時，通過圖4并結合上面的分析得出的最佳條件可以發現，料液比在1：30-1：37.53，乙醇濃度在60%-68.61%所形成的區域內，隨著乙醇濃度的增大和料液比的升高提取率有所增加，但增幅趨勢有所減緩，當乙醇濃度升到68.61%，料液比升至1：37.53 時，達到最大.

圖4 乙醇濃度和料液比對龍眼核多酚的影響

圖5 時間和乙醇濃度對龍眼核多酚的影響

圖6 料液比和時間對龍眼核多酚的影響

當料液比1：40固定時，由圖5并結合上述分析最佳條件可以看出，時間在2-2.76 min，乙醇濃度由60%-68.61%所形成的區域內，隨著乙醇濃度的增大和時間的增長，提取率一直增大，增幅趨勢逐漸減緩，當時間達到2.76 min，乙醇濃度增至68.61%時，達到最大.

當固定乙醇濃度為70%時，由圖6并結合上述分析最佳條件可發現，在提取時間為2-2.76 min，料液比為1：30-1：37.53所形成的區域內，隨著時間和料液比的增大，提取率不斷增長，但是增幅趨勢有所減緩；當時間增至2.76 min，料液比升至1：37.53時，達到最大.

3.3 驗證實驗

把響應面法分析得出的龍眼核多酚提取工藝的最佳提取條件，與實際可操作條件結合，選取料液比為1：40，乙醇濃度為65%，提取時間為3 min條件進行三次平行試驗，實驗結果見表4.所選條件比預測條件稍低，得出實際提取率比預測值也稍低，相對誤差4.92%.

表4 驗證實驗結果

3.4 降膽固醇試驗

圖7 不同濃度隨時間對清除率的影響

由圖7可知，隨著濃度的增加，龍眼核多酚對于膽固醇的清除率升高，但實驗表明：隨著時間的增大，多酚中含有多羥基易被氧化，使得其膽固醇清除率緩慢降低.

4 結論與討論

本研究以時間、乙醇濃度、料液比作為單因素，選定微波輔助萃取法，根據實驗設計得出不同的料液比、時間、乙醇濃度均對龍眼核多酚的提取率有影響，其中乙醇濃度的影響最為顯著.之后再通過三因素三水平的響應面實驗設計得到時間2.76 min，料液比1：37.53，乙醇濃度68.61%為最佳微波輔助龍眼核多酚提取工藝的條件，在此條件下，預測提取率為6.09%.為便于實際操作，提取時間3 min，乙醇濃度65%，料液比1：40的條件進行實驗，得到提取均值5.79%，比預測值稍低，其相對誤差為4.92%.通過響應面設計龍眼核多酚的提取實驗能夠提高龍眼核多酚的提取率，同時也為龍眼的廢料加以回收利用提供了新思路.

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