補(bǔ)腎祛痰法對(duì)膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清及關(guān)節(jié)液中炎癥因子的影響

鄭煒宏 唐劍邦 高大偉 吳宇峰 何君源 黃子奇

(中山市中醫(yī)院骨三科，廣東 中山 528400)

膝骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種由多因素導(dǎo)致的慢性退行性膝關(guān)節(jié)疾病，其主要病理特征是膝關(guān)節(jié)軟骨破壞、丟失及硬化等，甚至出現(xiàn)囊性病變并形成骨贅，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹、劇痛，其病變范圍還包括關(guān)節(jié)周圍骨骼、肌肉、韌帶和滑膜，關(guān)節(jié)功能出現(xiàn)進(jìn)行性功能障礙。OA在人群中的發(fā)病率非常高，尤其在老年人群中其發(fā)病率已經(jīng)超過37%〔1〕。既往OA的治療以鎮(zhèn)痛為主，治療帶來的胃腸道副作用較大〔2〕。OA在中醫(yī)學(xué)上屬于“痹病”范圍，主要病因是肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)、外邪痹阻，有痰、瘀之表現(xiàn)，現(xiàn)代生理學(xué)發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)滑液可以潤(rùn)滑和營(yíng)養(yǎng)關(guān)節(jié)腔，而中醫(yī)理論認(rèn)為津液化而為痰，推斷關(guān)節(jié)液與痰存在一定聯(lián)系〔3〕。本次研究采用補(bǔ)腎祛痰方治療大鼠OA模型，并分析其對(duì)大鼠血清及關(guān)節(jié)液炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD大鼠32只(由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重180～220 g。大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行科學(xué)無菌喂養(yǎng)，飲水自由。

1.2藥物制備 本研究采用補(bǔ)腎祛痰方進(jìn)行治療，主要藥物包括陳皮15 g、骨碎補(bǔ)15 g、續(xù)斷15 g、熟地黃15 g、杜仲15 g、川芎10 g、蒼術(shù)10 g、川牛膝10 g、法半夏10 g、甘草5 g。藥物均用水煎服，由院內(nèi)中藥制劑室提供。

1.3方法

1.3.1分組與造模 OA模型建立采用改良的Hulth法〔4〕，10%水合氯醛溶液，注射劑量為0.33 ml/100 g。手術(shù)造模過程需要嚴(yán)格堅(jiān)持無菌操作，手術(shù)采用膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口，檢查關(guān)節(jié)腔內(nèi)無原發(fā)病變，隨后將大鼠膝關(guān)節(jié)前后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶、內(nèi)側(cè)半月板切斷，手術(shù)過程中切勿損傷關(guān)節(jié)軟骨，進(jìn)行抽屜試驗(yàn)陽性后徹底止血，關(guān)節(jié)腔止血，并將少量青霉素溶液注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，逐層縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚，患處采用無菌敷料包扎，并不進(jìn)行固定。大鼠行膝骨關(guān)節(jié)術(shù)后每日用青霉素40×104U肌肉注射，無菌敷料進(jìn)行換藥，預(yù)防出現(xiàn)感染等并發(fā)癥。依據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，超疲勞活動(dòng)能夠使得OA提前發(fā)病〔5〕。因此，大鼠手術(shù)后1 w進(jìn)行每日30 min強(qiáng)迫活動(dòng)，持續(xù)4 w后則可以得到穩(wěn)定OA模型。造模成功后，按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、模型組、中藥組及西藥組，每組8只，對(duì)照組大鼠則僅將膝關(guān)節(jié)切開，韌帶并不切斷。

1.3.2治療方法 大鼠在完成造模后第4周進(jìn)行藥物治療，主要采用灌胃給藥。中藥組采用補(bǔ)腎祛痰法中藥制劑灌服，模型組及對(duì)照組大鼠灌服等量生理鹽水，西藥組大鼠則采用美洛昔康0.45 mg/kg灌服。藥物灌服治療每日1次，持續(xù)治療4 w〔6〕。

1.4觀察指標(biāo) ①基本情況觀察：主要觀察指標(biāo)包括大鼠毛發(fā)光澤程度、進(jìn)食量、體重變化、精神狀態(tài)及活動(dòng)量情況；②血液、關(guān)節(jié)液炎癥因子測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后腹腔取血4 ml，置于涂有肝素鈉的采血管中，3 500 r/min，離心10 min，吸取上清液即得血漿。另外抽取關(guān)節(jié)積液2 ml，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α〔7〕；③步態(tài)的評(píng)價(jià)〔8〕：實(shí)驗(yàn)大鼠在藥物治療8 w后觀察每日步態(tài)，步態(tài)狀況參考Coderre法進(jìn)行分級(jí)〔8〕，共4級(jí)：0級(jí)：實(shí)驗(yàn)大鼠能夠正常行走；Ⅰ級(jí)：大鼠出現(xiàn)輕度的跛行，膝關(guān)節(jié)以下略彎曲；Ⅱ級(jí)：大鼠出現(xiàn)中度跛行，患肢僅能觸到地面；Ⅲ級(jí)：大鼠重度跛行，患肢略微離開地面，其余3足著地行走；④膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)測(cè)量：在最后一次灌服藥物后30 min，麻醉各組大鼠，膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)采用軟尺進(jìn)行測(cè)量，手術(shù)膝關(guān)節(jié)與正常膝關(guān)節(jié)進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算腫脹率〔9〕，腫脹率(%)=(手術(shù)膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)-正常膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng))/正常膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用獨(dú)立樣本方差分析；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠基本情況 對(duì)照組大鼠毛發(fā)光亮，進(jìn)食正常，體重和精神狀態(tài)、活動(dòng)量無變化；模型組大鼠毛發(fā)暗淡，進(jìn)食量和體重下降，活動(dòng)量下降；中藥組和西藥組大鼠毛發(fā)光亮度一般，進(jìn)食量逐漸恢復(fù)正常，活動(dòng)量逐漸恢復(fù)。

2.2步態(tài)的評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)大鼠在藥物治療后第8周觀察步態(tài)，對(duì)照組大鼠表現(xiàn)正常，0級(jí)8只；模型組大鼠跛行嚴(yán)重，Ⅲ級(jí)7只，Ⅱ級(jí)1只；中藥組和西藥組大鼠步態(tài)均出現(xiàn)不同程度改善，中藥組0級(jí)2例，Ⅰ級(jí)5例，Ⅱ級(jí)1例；西藥組0級(jí)1例，Ⅰ級(jí)4例，Ⅱ級(jí)2例，Ⅲ級(jí)1例。

2.3膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)對(duì)比 對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)處在正常范圍內(nèi)，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)顯著高于中藥組、西藥組和對(duì)照組(P<0.05)，中藥組、西藥組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中藥組、西藥組、模型組大鼠腫脹率高于對(duì)照組(P<0.05)，中藥組、西藥組大鼠腫脹率低于模型組(P<0.05)，中藥組和西藥組大鼠的膝關(guān)節(jié)周長(zhǎng)和腫脹率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 補(bǔ)腎祛痰法治療膝關(guān)節(jié)炎大鼠膝周長(zhǎng)的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.4血清及關(guān)節(jié)液炎性因子水平對(duì)比 與對(duì)照組相比，中藥組、西藥組、模型組大鼠血清及關(guān)節(jié)液內(nèi)IL-1、IL-6及TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)；中藥組和西藥組大鼠血清及關(guān)節(jié)液內(nèi)IL-1、IL-6及TNF-α水平低于模型組(P<0.05)；中藥組與西藥組各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 補(bǔ)腎祛痰法治療OA大鼠血清和關(guān)節(jié)液炎性因子的影響

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為膝OA是一種慢性退行性關(guān)節(jié)病變，主要涉及膝關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨質(zhì)并形成關(guān)節(jié)軟骨的骨贅，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)兩部分組成，致病因素主要是對(duì)這二者進(jìn)行影響，從而導(dǎo)致病情出現(xiàn)。病理學(xué)研究表明〔10〕，IL-1主要是干擾關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝，促使關(guān)節(jié)軟骨降解。TNF-α與IL-1協(xié)同作用，同時(shí)還能夠誘導(dǎo)生成IL-6，在OA等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。相關(guān)研究表明〔11〕，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)IL-1、IL-6及TNF-α表達(dá)水平增加，且因子水平與炎癥嚴(yán)重程度存在正相關(guān)關(guān)系，可以作為疾病程度的參考指標(biāo)。在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)說中，膝OA均屬于“痹證”范疇，經(jīng)典中醫(yī)理論認(rèn)為膝OA與患者勞損、體衰、風(fēng)寒、濕邪存在密切關(guān)系，具體表現(xiàn)為肝腎虧虛、痰瘀互結(jié)，腎虛與血瘀二者相互作用，在疾病進(jìn)展過程中始終發(fā)揮重要作用，最終成痹。而關(guān)節(jié)腔內(nèi)含關(guān)節(jié)液，發(fā)揮潤(rùn)滑作用，中醫(yī)認(rèn)為關(guān)節(jié)液屬“津液”，津液在病理狀態(tài)下代謝則成為痰，因而中醫(yī)理論認(rèn)為〔12〕關(guān)節(jié)積液和痰之間存在聯(lián)系。本質(zhì)為氣虛陽虛，多痰、多濕則是表象。膝OA患者缺少運(yùn)動(dòng)鍛煉，導(dǎo)致肥胖提醒居多，脾失健運(yùn)，使得肝腎兩虛，水無歸源，留則顯濕，發(fā)而生痰，痰隨氣升，連通腹臟，進(jìn)而侵及筋骨關(guān)節(jié)。痰濕淤積，氣血不暢。因此，本研究采用中醫(yī)補(bǔ)腎祛痰法進(jìn)行治療，藥方內(nèi)主要藥物成分中，蒼術(shù)、陳皮、半夏等具有化痰除濕的功效，杜仲、熟地黃、牛膝、續(xù)斷等藥物則發(fā)揮強(qiáng)筋健骨、益氣補(bǔ)腎等作用，川芎則具有止痛活血的功能，兼有除濕行氣的效用，而甘草則能調(diào)節(jié)各藥性能，使其各自發(fā)揮作用，共同具備補(bǔ)腎祛痰的效果〔13〕。

本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)腎祛痰法藥劑能夠有效抑制關(guān)節(jié)軟骨退變，緩解滑膜炎癥。OA作為一種關(guān)節(jié)退行性病變，發(fā)病過程與腎具有緊密聯(lián)系，補(bǔ)腎是治療OA的關(guān)鍵療法，腎氣足則表明機(jī)體骨骼健壯，組方中的杜仲、熟地黃、牛膝、續(xù)斷能夠強(qiáng)健筋骨，補(bǔ)益腎臟；此外有學(xué)者認(rèn)為血瘀是OA發(fā)病的病因之一，腎是先天之本，腎虧則容易導(dǎo)致血流不暢，在關(guān)節(jié)中形成阻滯，導(dǎo)致關(guān)節(jié)失去營(yíng)養(yǎng)支持，同時(shí)還會(huì)造成風(fēng)濕痹痛，組方中川芎發(fā)揮止痛活血的功效；另外OA患者的致病原因還有濕熱和痰瘀，外濕在關(guān)節(jié)處積聚成痰，侵襲關(guān)節(jié)和經(jīng)絡(luò)，使得關(guān)節(jié)腫痛和變形等，方中的蒼術(shù)、陳皮、半夏主要起化痰除濕的作用〔14〕。除此之外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究分析其作用機(jī)制是補(bǔ)腎祛痰藥劑中的有效成分能夠抑制釋放軟骨細(xì)胞、滑膜內(nèi)炎性因子，使得軟骨細(xì)胞代償能力有效提高，軟骨細(xì)胞周圍代謝環(huán)境改善，在一定程度上緩解軟骨退變〔15〕。補(bǔ)腎祛痰法藥劑能夠發(fā)揮西藥同等效果。

綜上所述，補(bǔ)腎祛痰法能夠有效改善OA大鼠跛行狀況，能夠消除腫脹膝關(guān)節(jié)，更重要的是補(bǔ)腎祛痰法藥劑能夠有效抑制膝骨性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6、TNF-α水平，減輕炎性癥狀，其臨床作用需要進(jìn)一步進(jìn)行訓(xùn)練。

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