線粒體DNA變異與腫瘤的相關(guān)性研究進展

綜述 審校

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由多基因、多信號通路參與的復(fù)雜生物學過程。近10余年的研究表明，針對一種代謝特征的研究不適用于所有的腫瘤類型，對腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究及對臨床治療的探索正在突破越來越多的傳統(tǒng)模式。在線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）產(chǎn)生變異時，腫瘤細胞會發(fā)生遷移，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)移灶的形成。而線粒體作為細胞的“能量工廠”，在這一過程中充當了促使腫瘤轉(zhuǎn)移的“開關(guān)”。并且，mtDNA變異是涉及腫瘤疾病發(fā)展及預(yù)后等方面的重要因素，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用正備受關(guān)注。因此，進一步深入理解mtDNA變異的發(fā)生規(guī)律及作用機制，為腫瘤疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷提供有意義的參考是極有必要的。

1 腫瘤細胞中mtDNA的變異

mtDNA是高等動物細胞內(nèi)唯一的核外DNA，在調(diào)節(jié)線粒體功能方面起著至關(guān)重要的作用，其變異主要包括點突變、缺失、插入及拷貝數(shù)的改變，而近年一些研究也發(fā)現(xiàn)mtDNA和nDNA的比率與惡性腫瘤的發(fā)生及進展密切相關(guān)。

1.1 點突變

點突變是腫瘤細胞中最常見的mtDNA變異，線粒體 DNA 控制區(qū)（displacement loop，D-loop）是mtDNA轉(zhuǎn)錄復(fù)制的調(diào)控區(qū)，同時也是mtDNA突變的熱點區(qū)域，其中包含一個多聚胞嘧啶區(qū)（np303-np315），命名為D310，是惡性腫瘤mtDNA最常見的突變區(qū)。Shakhssalim等[1]在110個變異中發(fā)現(xiàn)了48個新突變，膀胱癌患者顯著存在C16069T變異；在D310中，包括C7TC6、C8TC6、C9TC6和C10TC6，這些變異在膀胱癌的病因中發(fā)揮重要作用，促進了對致癌突變的定義。De等[2]在核苷酸57處的mtDNA起始復(fù)制位點和D300-310區(qū)段中也證實了另外兩個點突變A4767G和G13481A。Ye等[3]評估來自乳腺癌患者的腫瘤、相鄰非腫瘤和良性乳腺疾病（benign breast disease，BBD）患者的組織樣本，發(fā)現(xiàn)D環(huán)區(qū)域的核苷酸16 106和16 437之間的MnⅡ位點突變可能影響乳腺癌的發(fā)生。Guo等[4]通過對40例人喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）患者的癌旁組織和外周靜脈血樣中的mtDNA檢測發(fā)現(xiàn)，有21例（52.5%）具有體細胞mtDNA D環(huán)突變，而在34個突變點中，28個（82.4%）位于HVⅡ，6個（17.6%）位于HVⅠ。Pereira等[5]認為腫瘤中體細胞mtDNA突變的致病性較非腫瘤組織顯著增高，且與氨基酸變異集合中的隨機選擇是無法分開的。Har?die等[6]在胰腺癌細胞系（patient derived cell lines，PD?CL's）中鑒定了24個mtDNA體細胞突變，在與線粒體代謝功能密切相關(guān)的1 000個nDNA中鑒定出另外18個突變，結(jié)果表明胰腺腫瘤的異質(zhì)基因組可能會有共同的代謝表型，但不同腫瘤是通過不同的遺傳機制完成合成代謝需求。

1.2 缺失及插入

目前，在腫瘤細胞中已發(fā)現(xiàn)超過一百種mtDNA片段缺失，其中mtDNA 4 977 bp（np8 470-np13 447）大片段缺失是最為常見的一種。Tao等[7]對中國溫州地區(qū)104例結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）患者的臨床特征和mtDNA進行了全面分析，表明在CRC的早期階段可能出現(xiàn)大量4 977 bp片段缺失，且隨著腫瘤TNM分期增高缺失數(shù)量降低。Nar等[8]研究表明當哇巴因與2-脫氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）聯(lián)合時，mtDNA損傷和mtDNA4977缺失頻率增加，哇巴因可以通過在癌細胞中引起氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)DNA損傷和細胞凋亡。Han等[9]證實了mtDNA片段的缺失可以抑制肺癌細胞的生物合成和代謝，而C-myc可能作為缺氧和放射條件下的關(guān)鍵基因，在誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡中起到重要作用。Datta等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在健康組和白細胞組的mtDNA缺失分別比癌組織低9.8倍和10.5倍，已發(fā)現(xiàn)的mtDNA插入呈現(xiàn)不明顯特異性。Ye等[11]評估了來自55例原發(fā)性乳腺癌患者和21例BBD患者的腫瘤組織和鄰近組織，發(fā)現(xiàn)在所有樣本中檢測到mtDNA4977插入突變，其水平為0.000 149%～7.0%，雖然目前研究提示這些插入不具有腫瘤特異性，但其可能會作為衡量腫瘤變異度的相關(guān)因素。

1.3 拷貝數(shù)變異

mtDNA功能的發(fā)揮既依賴于其分子結(jié)構(gòu)的完整性，同時也與細胞中mtDNA拷貝數(shù)密切相關(guān)。Castle等[12]使用500萬33 nt的讀數(shù)檢測到人肺良性腫瘤細胞（UMC-11）的大量拷貝數(shù)變異。Mengelfrom等[13]在對1 067例年齡為18～93歲丹麥患者研究中發(fā)現(xiàn)血液中的mtDNA通過拷貝增加更多的mtDNA組群，與老年人的健康水平及生存質(zhì)量密切相關(guān)。Cui等[14]研究中發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中的mtDNA拷貝數(shù)與相應(yīng)的非腫瘤組織相比較低，較低mtDNA拷貝數(shù)的患者比較高mtDNA拷貝數(shù)的患者3年生存率低，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，證實了mtDNA拷貝數(shù)的高低與CRC的惡性程度顯著相關(guān)。并且，mtDNA拷貝數(shù)的改變在不同類型腫瘤中有著顯著性差異[1-4，14-28]：腦癌、食管癌、喉癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺乳頭狀癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中mtDNA拷貝數(shù)明顯增加，而肝癌、胃癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌及尤氏肉瘤組織中mtDNA拷貝數(shù)顯著降低。Luna等[15]發(fā)現(xiàn)mtDNA3196G、9952A、10006G、10398G的突變，mtD?NA氧化損傷和mtDNA拷貝數(shù)增高的組合效應(yīng)使女性兒童腦腫瘤發(fā)病率超出兒科腦腫瘤正常發(fā)病率的51倍，其結(jié)果對兒童腦腫瘤的治療具有指導(dǎo)意義。研究證實氧化磷酸化產(chǎn)能或者呼吸功能的下降可能有助于腫瘤細胞增殖及侵襲能力的增強，而mtDNA作為對其的一種適應(yīng)性反應(yīng)則表現(xiàn)出拷貝數(shù)量的增加，在一定程度上導(dǎo)致突變進行性累積，為腫瘤細胞的惡性變異、轉(zhuǎn)移蓄積了內(nèi)在動力。因此，通過選擇性地誘導(dǎo)mtDNA損傷，調(diào)控mtDNA的拷貝數(shù)量將有助于腫瘤的靶向治療。

1.4mtDNA/nDNA

mtDNA誘發(fā)細胞癌變的另一個可能途徑是通過mtDNA分子及片段在nDNA中整合來實現(xiàn)的，并使mtDNA與nDNA的比值產(chǎn)生變化。Evdokimovsky等[16]觀察到放療輻射后的小鼠，其有核血細胞中的氧化磷酸化相關(guān)基因cytb、ATP6、ND4、ND2和D環(huán)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄，血液細胞中mtDNA/nDNA的比例減少50%，血清中mtDNA/nDNA比值增加，這種釋放進入血液循環(huán)的機制，被認為是由于腫瘤的增生或轉(zhuǎn)移引起的細胞凋亡、組織壞死、炎癥和線粒體功能障礙所導(dǎo)致的。Chiba等[17]對mtDNA單層（2D）和三維（3D）培養(yǎng)的CRC細胞進行比較，與2D細胞相比，在3D細胞中觀察到mtDNA水平顯著降低，且在3D球狀細胞培養(yǎng)物中觀察到的mtDNA/nDNA比值降低。表明與缺氧條件相比，CRC細胞在含氧量正常條件下，其胞質(zhì)中所含的大量線粒體會使細胞增殖分化失控，誘發(fā)癌變。Zhang等[18]在放療輻射6個月后的BALB/c小鼠肝臟中觀察到mtDNA/nDNA比例升高，而肌肉、非再生器官表現(xiàn)出mtDNA的減少，肝臟中較高的mtDNA含量是該器官適應(yīng)高氧化應(yīng)激的結(jié)果，提示在接受放療的腫瘤患者中，mtDNA/nDNA可能作為今后重要的臨床診斷依據(jù)。Mohammed等[19]在6例CRC組織和3例健康對照中發(fā)現(xiàn)，線粒體基因tRNALeu（CUN）中的多態(tài)性突變A12308G可能是mtDNA與nDNA結(jié)合產(chǎn)生癌癥的致病突變，可能用作未來的診斷工具之一。因此，mtDNA除了自身的變化可使其成為一種潛在的致癌靶標，還能通過與nDNA的相互作用激發(fā)細胞的癌變潛能。

2 mtDNA變異與腫瘤的發(fā)生

Zhang等[20]發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）患者中mtDNA含量比健康對照組顯著升高。Bao等[21]發(fā)現(xiàn)mtDNA在老年肝癌（hepato?cellular carcinoma，HCC）患者的病因中起著關(guān)鍵作用。Platek等[22]發(fā)現(xiàn)mtDNA突變在乳腺癌中尤其是雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性的乳腺癌患者中更為頻繁，證實了其可以參與誘導(dǎo)乳腺癌發(fā)生。Feng等[23]研究表明mtDNA突變可能影響人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染和宮頸癌的發(fā)生。Chen等[24]研究表明C-myc基因可能通過參與mtDNA的序列整合到子宮頸上皮細胞核中，并參與子宮頸上皮細胞癌的發(fā)生。Chattopadhyay等[25]在口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織中發(fā)現(xiàn)，mtDNA突變和拷貝數(shù)在癌癥組織中呈低表達，推測氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）復(fù)合蛋白的功能損傷可能有利于癌細胞生長。Liu等[26]將OSCC患者非癌組織中mtDNA序列與癌組織的D環(huán)進行比較，發(fā)現(xiàn)大量體細胞突變。Zhang等[27]進一步通過克隆和測序mtDNA D環(huán)區(qū)域，發(fā)現(xiàn)D環(huán)中的體細胞突變在癌組織中顯著增多，并且Datta等[10]也證實D環(huán)中的體細胞突變可促進癌癥發(fā)生。Lee等[28]基于CRC中端粒和線粒體的頻繁遺傳變化，從109例CRC組織、64例結(jié)腸直腸管腺瘤和28例鋸齒狀息肉中提取mtDNA，其PCR結(jié)果表明，端粒和線粒體之間的調(diào)節(jié)功能喪失可能觸發(fā)癌癥因子，促使CRC的發(fā)生。因此，對mtDNA突變的檢測可能會成為癌癥早期篩查的重要參考指標。

3 mtDNA變異與腫瘤發(fā)展及預(yù)后

Zhang等[29]認為低mtDNA拷貝數(shù)可能提示了晚期胃癌患者的不良預(yù)后，可變mtDNA含量增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險和晚期患者的死亡率。Bao等[21]認為在HCC患者中，較長的白細胞相對端粒長度以及較低的mtDNA拷貝數(shù)預(yù)示較差的預(yù)后。Dang等[30]認為低mtDNA含量與一些臨床病理特征如吸煙、TNM分期密切相關(guān)，可能導(dǎo)致喉癌患者的不良預(yù)后，與腫瘤患者生存率具有一定的相關(guān)性。Feng等[23]認為高mtDNA含量加上10398A突變可能是宮頸癌預(yù)后不良的標志物。Yeung等[31]在GBM細胞系的編碼和非編碼區(qū)域內(nèi)鑒定了大量的mtDNA變體，頻率在D環(huán)最大，且p53突變顯著增加，蛋白質(zhì)基因ND6是最易發(fā)生的突變基因，而蛋白質(zhì)基因ND4具有最高的突變頻率，新型變體通過提供電子傳遞鏈（electron transfer chain，ETC）來促進GBM的發(fā)展，促進厭氧糖酵解的發(fā)生，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖的加速。Chen[32]指出上皮癌細胞和癌相關(guān)基質(zhì)中線粒體功能的調(diào)節(jié)異常可促進轉(zhuǎn)移灶的形成，mtDNA D環(huán)的體細胞突變與癌癥患者的生存率相關(guān)，這種突變負荷的增加提示正常細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化。總之，mtDNA已經(jīng)作為新型的腫瘤標志物對不同腫瘤發(fā)展的各個時期及患者預(yù)后情況的判定起到重要作用。

4 mtDNA變異與腫瘤臨床治療

Ye等[33]通過PCR技術(shù)準確定量在血漿提取循環(huán)細胞mtDNA，第三代PCR檢測（droplet digital PCR，ddPCR）被證明比實時熒光定量檢測（quantitative PCR，qPCR）技術(shù)更簡單和靈敏，而沒有提取的血漿可以直接用于ddPCR中檢測外源核酸。D-loop是影響活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生mtDNA改變的熱點，錳超氧化物歧化酶（mitochondrial super?oxide dismutase，Mn-SOD）是保護細胞免受ROS介導(dǎo)損傷的抗氧化酶。Govatati等[34]通過分析線粒體D環(huán)和Mn-SOD表達的CRC序列改變之間的關(guān)系，證實線粒體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（mitochondrial microsatellite instability，mtMSI）和Mn-SOD過度表達的檢測，可能有助于識別高風險的患者。Safdar等[35]報道聚合酶-γ射線（polymerase-gamma1，POLG1）被認為是目前唯一的mtDNA修復(fù)酶，證明p53在運動介導(dǎo)的維護mtDNA中的作用，并證實了線粒體靶向p53作為線粒體病因疾病的新型治療方式。Ishikawa等[36]認為高轉(zhuǎn)移特性的腫瘤細胞mtDNA中ND6基因的G13997A突變導(dǎo)致了ROS的過量產(chǎn)生，為腫瘤轉(zhuǎn)移提供條件，這意味著抗氧化劑的使用可以有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。Yeung等[37]研究表明博來霉素可以作為誘導(dǎo)急性髓細胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）細胞mtDNA損傷的藥物，且在原代AML中發(fā)揮同樣作用，采用mtDNA靶向治療可能是AML的有效方法。mtDNA變異的相關(guān)研究將不斷應(yīng)用于臨床，為生物醫(yī)學的進步提供更廣闊的空間。

5 結(jié)語

線粒體作為為生命體提供能量的場所，是腫瘤細胞代謝環(huán)節(jié)的關(guān)鍵點。目前，對mtDNA變異是否是腫瘤發(fā)生的誘因尚不明確，mtDNA在腫瘤治療中的作用研究也存在著樣本量小、研究方法不統(tǒng)一、對不同腫瘤類型及腫瘤發(fā)生發(fā)展各個階段的針對性不明確等弊端。因此，未來更需要注意的是，針對mtD?NA變異的靶向治療研究不能拘泥于某單一位點，而是要結(jié)合其單倍體類型，規(guī)避表觀遺傳改變，使其在臨床治療中適用于腫瘤發(fā)生發(fā)展等不同階段的代謝變化。

綜上所述，由于腫瘤生物學的高度復(fù)雜性，臨床上更迫切的需要新的治療方法，而掌握腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的線粒體代謝的參與過程及機制可以為臨床綜合治療提供新的思路。相信隨著科學研究的深入，mtDNA變異與腫瘤等各類疾病的相關(guān)性會被更進一步地揭示，以線粒體為靶向的腫瘤治療方案也將廣泛應(yīng)用于臨床。

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