侵襲性真菌病血清學檢測研究進展

周夢蘭 ， 徐英春 ， 趙玉沛

近年來，條件致病性真菌感染，特別是深部真菌病的發病率和病死率呈明顯上升趨勢[1]。侵襲性真菌感染是深部真菌病中危害最大的一類，常發生于免疫功能低下如接受造血干細胞移植的患者，其病情進展快，病死率可達50%[2]。早期快速診斷有助于及時控制病情，改善預后。由于侵襲性真菌病（IFD）臨床表現及體征不典型，且常被基礎疾病掩蓋，因此其診斷主要依賴于實驗室檢查。傳統的真菌實驗室診斷方法主要包括真菌鏡檢、培養和組織病理鑒定，但這些診斷方法的特異度和靈敏度均較低，檢測周期長，存在診斷延遲的可能，而創傷性診斷手段常受到患者病情和身體狀況的限制。靈敏、特異、早期、快速的非培養診斷方法已成為IFD研究領域的焦點。隨著檢測技術的進步，目前與傳統檢測方法不同的其他技術開始在IFD檢測領域發揮越來越重要的作用，包括血清學檢測技術以及分子生物學檢測技術。IFD血清學診斷主要包括抗體檢測及抗原、代謝產物檢測兩大類，本文就這兩方面作一綜述。

1 抗原及代謝產物

1.1 （1, 3）-β-D-葡聚糖（BDG）

BDG廣泛存在于真菌細胞壁中（除接合菌外），可占其干重的50%以上，而其他微生物、動物及人的細胞則不含這種成分。人體的吞噬細胞吞噬真菌后，能持續釋放該物質，使得血液及其他體液（如尿、腦脊液、腹水、胸水等）中BDG含量增高。在無內毒素存在的情況下，BDG可以活化鱟變形細胞裂解物中的G因子并產生凝集反應。以此反應原理為基礎的G試驗可以特異性檢測BDG。因此，如果在血液或其他無菌體液中檢測到BDG，就提示可能存在真菌感染，但也有其局限性。以下情況下G試驗可能出現假陽性，如：使用纖維素膜進行血液透析的患者，標本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；患者靜脈輸注凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白；使用抗菌藥物如頭孢西丁、頭孢唑林、甲氧芐啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟等；標本溶血、脂血、黃疸；使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的黏膜損傷導致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌經胃腸道進入血液等也可能造成假陽性；此外，由于G試驗的測定原理與內毒素十分相似，所以易受血中革蘭陰性菌的干擾，造成假陽性。有研究發現1例大腸埃希菌感染者G試驗為陽性，其測定值大于120 pg/mL[3]。在診斷隱球菌或接合菌（根霉/毛霉）感染時，G試驗常出現假陰性結果，可能與其生長緩慢，形成厚壁胞膜有關。臨床常見的肺曲霉病，由于有厚壁空洞的包繞，真菌胞壁的結構成分難以被釋放入血，也會出現假陰性結果。

由于BDG廣泛存在于真菌細胞壁中，因此G試驗可以檢測除隱球菌和接合菌以外的多種病原真菌，包括念珠菌、曲霉、鐮刀菌、肺孢菌、地霉和毛孢菌等感染。目前，國內外使用的G試驗試劑盒種類繁多，不同的試劑盒存在原料、檢測方法及閾值的差異，加之導致G試驗假陽性的因素眾多且難以避免，G試驗結果陽性只表明存在深部真菌感染，但不能提示為何種真菌[4]。連續2次或更多次G試驗陽性可提高G試驗對IFD診斷的特異度，對于IFD早期診斷有一定價值，且該指標能動態反映感染程度和抗真菌治療療效，但需要關注結果的假陽性。念珠菌定植不引起G試驗升高。因此在臨床工作中建議：與半乳甘露聚糖檢測試驗（GM試驗）聯合以提高陽性率；2次或2次以上陽性結果可降低假陽性率；高危患者建議每周檢測1～2次；并對高危人群進行動態監測。

1.2 半乳甘露聚糖（GM）

GM是第1個用于侵襲性曲霉病診斷的特異性抗原，菌絲生長時，GM從薄弱的菌絲頂端釋放，是最早釋放的抗原，主要用于急性侵襲性曲霉病的診斷[5]。GM釋放量與菌量呈正比，可以反映感染程度，所以可以作為療效的評價指標。可檢測的標本類型包括血清、血漿、支氣管肺泡灌洗液（BALF）或腦脊液，主要通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）或酶免疫測定（EIA）進行測定，靈敏度可達0.5～1.0 ng/mL[5]。以下情況下GM試驗可能出現假陽性，如：靜脈用哌拉西林-他唑巴坦；使用免疫球蛋白、血液制品；大劑量使用激素；透析；化療的嚴重黏膜炎的患者；兒童和新生兒。另外，抗真菌藥物，如三唑類抗真菌藥物的使用可降低GM水平，尤其是預防性使用伊曲康唑，輕度的侵襲性曲霉病和低曲霉負荷量可導致GM試驗陰性[6]。

研究顯示GM試驗可推薦用于惡性血液腫瘤患者和造血干細胞移植受體（靈敏度為70%～82%，特異度為86%～92%），但不推薦用于實體器官移植受體（靈敏度 22%）[7]。薈萃分析顯示，GM試驗對侵襲性曲霉病的靈敏度和特異度為71%～87%和89%，而BALF中GM試驗的靈敏度可能要高于血清GM試驗[8]。因此臨床檢測推薦同時檢測BALF和血清的GM水平，以提高其檢測靈敏度，但需要注意其交叉反應可發生于以下菌種的感染：馬爾尼菲籃狀菌、擬青霉、深紅酵母、新生隱球菌、頭地霉、枝頂孢霉、鏈格孢霉等。同時，研究表明G試驗和GM試驗聯合檢測可更有效診斷侵襲性曲霉病[9]。

1.3 隱球菌莢膜多糖

隱球菌感染后在體內可形成大量莢膜多糖并釋放進入血液和腦脊液，通過檢測莢膜多糖抗原可早期診斷隱球菌感染。膠乳凝集試驗檢測隱球菌莢膜抗原是最有診斷價值的快速血清學方法之一，可方便、快速、準確地從腦脊液或血中檢測出多糖抗原，其靈敏度高于常規墨汁染色和培養[10]。早期檢測試劑主要以多克隆抗體IgG為基礎，靈敏度可達99%，但有時受血中或體液中某些成分如類風濕因子（RF）等干擾，造成假陽性結果。以鼠單克隆抗體IgM為基礎的乳膠試劑雖不與RF發生交叉反應，但靈敏度不如多克隆抗體試劑盒。假陰性結果主要由前帶效應（抗體過量）引起，可對樣本進行一定稀釋后再檢測。現有的隱球菌抗原檢測商品化試劑盒采用多克隆抗體捕獲抗原，再用單克隆抗體進行檢測，可同時提高靈敏度和特異度。此外，通過對莢膜多糖抗原的定量檢測可用于對患者的療效評價，但在免疫功能低下患者（如AIDS患者）中應用時應結合其他實驗室結果進行解釋[11]。

1.4 甘露聚糖

甘露聚糖是念珠菌細胞壁另一重要組成成分，主要結構為D-甘露糖，對熱穩定，主要用于檢測侵襲性念珠菌病，一過性或導管相關性念珠菌血癥基本檢測不到甘露聚糖抗原。但是，由于血清中甘露聚糖清除較快，因此需重復采樣進行檢測，每周2～3次，可通過不斷改進檢測方法，如檢測前加熱血清使免疫復合物解離、采用單克隆抗體檢測特定靶位等提高靈敏度[12]。

1.5Cand-Tec抗原

Cand-Tec抗原是念珠菌屬的一種熱敏糖蛋白抗原，可用一種顆粒凝集試驗系統（又稱Latex凝集法）檢測。Misaki等[13]研究者利用微滴度法對12例急性白血病化療后發熱的患者進行Cand-Tec抗原檢測，發現其滴度均有明顯增高，靈敏度和特異度分別達100%和80%，抗真菌藥物治療后，75%患者Cand-Tec抗原滴度降低，治療無效者其抗原滴度未見降低。研究結果提示Cand-Tec抗原檢測可用于早期診斷深部念珠菌病，連續監測可評價療效，但陽性結果受RF的干擾，故僅用Cand-Tec試驗尚難確診深部念珠菌感染。

1.6 烯醇化酶

烯醇化酶是一種胞質抗原，又稱2-磷酸D-甘油鹽水解酶，是糖酵解所必需的胞內酶，廣泛存在于念珠菌細胞中，在深部念珠菌感染時可大量釋放入血，而寄生在淺表部位的念珠菌不會釋放該酶，故具有很高的臨床應用價值，但目前尚無檢測烯醇化酶抗原的商品化試劑。

1.7D-阿拉伯糖醇

D-阿拉伯糖醇是白念珠菌感染人體的產物。檢測血清中D-阿拉伯醇或D-阿拉伯糖醇與L-阿拉伯醇的比值，可幫助臨床診斷某些念珠菌如白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、乳酒念珠菌引起的深部感染，但不能檢測克柔念珠菌和光滑念珠菌感染[14]。

1.8 莢膜組織胞漿菌多糖抗原（HPA）

播散性莢膜組織胞漿菌病和有嚴重肺部感染癥狀患者的血、尿、BALF、腦脊液中均可檢出HPA[15-16]，目前主要通過放射免疫法進行測定，可用于莢膜組織胞漿菌的診斷和治療效果監測，但是由于檢測試劑具有放射性，限制了其在臨床的常規應用。

2 抗體檢測

與真菌抗原檢測相比，真菌血清特異性抗體檢測的研究和臨床應用相對滯后，其主要原因是過去人們認為抗體檢測的特異性較差，不能區分是體內定植還是感染；而機會性真菌感染常發生在機體免疫功能低下的人群，難以產生足夠量的抗體，易發生假陰性[17]。但是近年來的研究表明，定植和感染的患者其特異性抗體水平存在顯著差異；而存在免疫缺陷的患者也可以產生足夠的抗體水平從而用于IFD的診斷。同時，隨著人們對慢性真菌病如慢性肺曲霉病（CPA）認識的加深，真菌特異性抗體檢測已經成為IFD診斷的重要方法。目前用于IFD診斷的抗體標志物擇要介紹于下。

2.1 白念珠菌牙管特異性抗體（CAGTA）

CAGTA可用于侵襲性念珠菌病的早期診斷，包括白念珠菌和非白念珠菌，研究顯示在危急和非危急念珠菌病患者中其靈敏度和特異度分別達77%～89%，91%～100%。此外，采用微滴度法連續監測CAGTA濃度可以對治療效果進行監測。在一項大型回顧性多中心研究中，研究者發現危重患者CAGTA檢測陽性率達41.5%，以手術患者居多，占60%，隨著抗真菌藥物的治療，CAGTA滴度隨之增加，患者的病死率也隨之降低[18]。

2.2 甘露聚糖抗體

甘露聚糖抗原是念珠菌細胞壁的重要組成成分，但在血液中清除較快；甘露聚糖抗體的檢出則不能確定感染或定植，但研究顯示，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗體聯合檢測可提高侵襲性念珠菌病的陽性率[19]。一項納入血液腫瘤和危重患者的系統性回顧研究顯示，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗體聯合檢測優于其單獨檢測，靈敏度和特異度分別達83%和86%[20]。值得注意的是，甘露聚糖抗原/甘露聚糖抗體聯合檢測效果對不同念珠菌種也有所差異，白念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌效果最好，而對近平滑念珠菌、克柔念珠菌效果最差[21]。

2.3 曲霉抗體檢測

與GM抗原相比，曲霉抗體的檢測，主要在慢性及過敏性曲霉病的診斷中發揮關鍵作用。慢性曲霉病中升高的抗體主要為IgG，過敏性曲霉病中升高的抗體主要為IgA和IgE，不同患者因個體差異也會出現抗體水平的交叉，但在免疫缺陷患者中，抗體水平升高可能會延遲或消失[5]。現有的檢測方法包括凝膠沉淀法、雙向免疫擴散法、血細胞凝集法、補體結合法、ELISA和免疫印跡法，但各種方法因其閾值和檢測抗體的不同，很難標準化。2016年更新的美國IDSA曲霉病診斷與處置指南中，強烈推薦血清和BALF GM試驗用于惡性血液病和造血干細胞移植患者侵襲性曲霉病的檢測[22]。

2.4 雙相真菌特異性抗體

一些特殊的雙相性真菌，主要是用常規方法難以診斷的地方性機會性真菌感染，如芽生菌病、球孢子菌病、組織胞漿菌病、副球孢子菌病和青霉病，可以用其特異性抗體進行早期診斷。檢測方法包括：ELISA檢測特異性IgM和IgG抗體及其滴度；補體結合試驗檢測抗體及其滴度；免疫擴散法檢測特異性抗體。早期研究報道顯示，在莢膜組織胞漿菌感染的抗體檢測中，ELISA和免疫擴散法檢測IgG抗體的方法敏感度分別達97%、100%，特異度分別達到84%和100%[23]。

3 臨床意義

為了進一步規范IFD的診斷，國際和國內許多醫學專業委員會及機構先后制定了診斷標準，其中最具有權威性和影響性的是歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協作組（EORTC/IFICC）和美國真菌病研究組（MSG）所制定的診斷標準[24]。該診斷標準將IFD的診斷分為確診（proven）、臨床診斷（probable）和擬診（possible） 3個層次，并分別從宿主因素、臨床標準、微生物學標準和組織病理等4個方面進行診斷。G試驗、GM試驗和隱球菌抗原檢測均被該標準列入微生物學標準。同時，中華醫學會不同專業委員會也根據我國的實際情況和特點，參考歐洲和美國等標準制定了我國自己的IFD診斷標準。無論在國際還是國內的標準中，G試驗、GM試驗和隱球菌抗原檢測均被列入微生物學標準[25]。由此可見，G試驗、GM試驗和隱球菌抗原檢測在IFD的診斷中具有重要的地位。

3.1G試驗

由于BDG廣泛存在于真菌細胞壁中，因此G試驗可以檢測除隱球菌和接合菌以外的多種致病真菌，包括念珠菌、曲霉、鐮刀菌、肺孢菌、地霉和毛孢菌等。國內外IFD的診斷標準中都將G試驗檢測結果列入微生物學標準[26-31]。值得注意的是，在肺真菌病診斷和治療專家共識[27]、實體器官移植患者侵襲性真菌感染的診斷和治療指南[28]和重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南[29]中都強調了連續2次G試驗陽性結果在IFD診斷中的重要性。

3.2GM試驗

除G試驗外，國內外侵襲性真菌病的診斷標準也將真菌GM試驗列為IFD診斷的微生物學標準[1，26-30]。和G試驗類似，多個國內指南[27-29]均強調了連續2次GM試驗結果陽性在診斷中的重要意義。指南中也指出，對于肺曲霉病，BALF GM試驗檢測可能優于血清GM檢測。但同時，指南中也指出GM試驗對器官移植患者的檢測效果不佳以及預防治療會影響GM試驗檢測結果。

3.3 隱球菌抗原檢測

在EORTC/MSG 2008年的侵襲性真菌診斷標準和國內的隱球菌感染診治專家共識（2010）中，腦脊液隱球菌抗原檢測陽性可以作為播散性隱球菌病確診的證據，而隱球菌抗原檢測也被列為其他隱球菌感染的重要微生物學證據[32]。

3.4 念珠菌特異性抗原抗體檢測

雖然G試驗對于IFD的檢測有很大的作用，但是其無法區別不同屬間的真菌感染。而念珠菌的抗原抗體檢測則可以特異性識別侵襲性念珠菌感染。這其中，又以念珠菌甘露聚糖抗原檢測和甘露聚糖抗體檢測最具有代表性。在2012年ESCMID念珠菌病診斷和治療指南中[33]，推薦使用念珠菌甘露聚糖抗原檢測和甘露聚糖抗體檢測作念珠菌血癥和慢性播散性念珠菌病的診斷方法（Level II）。而在2012年歐洲白血病感染會議指南[20]中也推薦使用念珠菌甘露聚糖特異性抗原和抗體檢測作為侵襲性念珠病的診斷方法，并且特別強調了甘露聚糖抗原和抗體聯合檢測效果要優于抗原或抗體單獨檢測。

3.5 曲霉抗體檢測

過去人們對曲霉抗體檢測的研究并不清楚，隨著近年來對侵襲性曲霉病研究的深入尤其是對CPA認識的加深，以及GM試驗對CPA的診斷效果不盡如人意，科研人員越來越重視曲霉抗體檢測在侵襲性曲霉病尤其是慢性曲霉病診斷中的作用[5]。在2015年出版的歐洲慢性肺曲霉病診斷和治療的臨床指南中[34]，特別強調了曲霉IgG抗體檢測、曲霉IgM抗體檢測和曲霉IgE抗體檢測在CPA診斷中的重要作用。2016年更新的美國IDSA曲霉病診斷與處置指南中，更是強調了曲霉IgG抗體檢測是慢性空洞性肺曲霉病診斷中最靈敏的微生物學方法[22]。

綜上所述，真菌抗原及其代謝產物檢測、真菌抗體血清學檢測作為非傳統培養的真菌檢測手段，已在臨床檢測領域有較廣泛的應用，但其靈敏度和特異度有待進一步提高，尤其是操作程序的標準化方面需要取得一致，以利于實驗室之間的比較和臨床應用。應將傳統的形態學檢查、培養法與非培養法結合起來，對真菌感染診斷提供可靠的實驗室依據。

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