TLR4介導中藥干預腦缺血炎癥損傷的研究進展*

岳少乾，孫作艷，李 霖，張翕婷，朱金墻，張 晗

（天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

炎癥反應是參與腦缺血損傷的重要病理機制，而缺血區(qū)恢復血流有加劇腦缺血損傷的風險，導致腦缺血區(qū)炎癥反應的惡性循環(huán)。Toll樣受體4（TLR4）在中樞神經系統(tǒng)內廣泛表達，腦缺血損傷后多種內源性配體釋放，激活TLR4，隨后激活的TLR4通過信號級聯(lián)傳導，激活轉錄因子:核轉錄因子-κB（NF-κB）、激活劑蛋白-1（AP-1）、干擾素調節(jié)因子3（IRF3）從而產生多種炎癥因子、Ⅰ型干擾素(IFN)，減輕或進一步加重缺血損傷[1]。近年研究表明,中藥由于多成分、多途徑、多靶點的作用特點，使其可以抑制TLR4轉導途徑中多個信號蛋白分子，從而有效抑制腦缺血損傷過程中的炎癥反應。

1 TLR4簡介

Toll樣受體4（TLR4）是參與固有免疫反應的重要的模式識別受體蛋白，為Toll樣受體（TLRs）家族中的基礎成員，通過識別病原體相關分子模式配體（PAMPs）或損傷相關分子模式配體(DAMPs)并與之結合，從而觸發(fā)機體的固有免疫應答機制。能夠被TLR4識別的PAMPs包括來源于多種微生物（寄生蟲、細菌、真菌、病毒）的致病體，如脂類、脂蛋白、蛋白質、和核酸等；而DAMPs主要包括機體損傷后自身釋放的內源性分子，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）,熱休克蛋白等[2-6]。

2 TLR4信號轉導途徑

TLR4信號轉導途徑可以分為髓樣分化因子88（MyD88）依賴性和β干擾素TIR結構域銜接蛋白（TRIF）依賴性信號通路。作為第一個被認定的TIR家族成員，MyD88被所有TLRs家族成員除ToLL校受體 3（TLR3）外所共有，并且通過激活 NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路而產生炎性細胞因子[7]。相反，TRIF僅作為TLR3、TLR4的募集蛋白，并且通過替代途徑激活轉錄因子IRF3、NF-κB，隨后產生Ⅰ型IFN和炎性細胞因子[5]。通過TLR4/NF-κB介導的炎癥反應，需要MyD88和TRIF信號通路同時參與；而通過TLRs其他成員介導的炎癥反應，只需要MyD88或者TRIF信號通路參與[3，5]，提示阻斷TLR4的募集蛋白 MyD88，TLR4/NF-κB介導的炎癥反應就會被抑制。

3 TLR4與腦缺血炎癥損傷

腦缺血后，中樞神經系統(tǒng)產生的內源性配體以及外周產生通過血腦屏障進入中樞神經系統(tǒng)的內源性配體,被小膠質細胞膜表面的脂多糖受體CD14和TLR4受體識別并結合,小膠質細胞活化，隨后轉化為類似巨噬細胞形態(tài)和功能的特異性小膠質細胞，一方面釋放細胞毒性（細胞因子、細胞黏附分子、趨化因子、一氧化氮、活性氧、前列腺素）或神經保護類細胞細胞因子（腦源性神經生長因子、促生長因子等），另一方面又能吞噬病變神經元，從而在中樞神經系統(tǒng)內發(fā)揮免疫活性[6，8-12]；同時，星型膠質細胞通過TLRs識別并結合內源性配體而被激活,分泌各種炎癥因子包括:細胞因子、趨化因子、一氧化氮等[8]；兩者釋放的炎癥因子隨后又誘導內皮細胞分泌大量細胞黏附分子，導致血液中的中性粒細胞浸潤于缺血區(qū)域腦組織，進一步激活膠質細胞。而神經元，一方面受膠質細胞釋放的炎癥因子的影響，加重自身損傷，另一方面又通過自身TLRs識別并結合內源性配體，釋放多種炎癥因子[8,12]。最終導致炎癥反應的惡性循環(huán)，進一步加重腦缺血損傷。

4 中藥調控TLR4信號轉導途徑減輕腦缺血炎癥損傷

4.1 中藥通過 TLR4/NF-κB途徑減輕炎癥反應 TLR4主要通過MyD88和TRIF途徑激活NF-κB。一方面，MyD88 N末端死亡結構域白介素（IL）-1受體相關激酶（IRAK）家族成員之間的相互作用；IRAK4最先被激活，隨后誘導IRAK1的磷酸化，磷酸化的IRAK4、IRAK1從MyD88內TIR結構域分離并且和E3泛素連接酶-腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）相互作用，被激活的TRAF6和E2、Ubc13、Uev1A共同促進TRAF6本身和NF-κB必需調節(jié)蛋白（NEMO）63位賴氨酸的泛素化；隨后泛素化的TRAF6和NEMO募集蛋白激酶轉化生長因子激活激酶1（TAK1）、轉化生長因子激活激酶1結合蛋白（TAB）,最終 IκB 激酶（IKK）的 β 亞基被激活，使IκB-α32、36 和 IκB-β19、23 位絲氨酸 N-末端發(fā)生磷酸化，隨后發(fā)生泛素化，最終降解并且暴露出P65的核定位序列，隨即NF-κB在胞漿和細胞核穿梭的動態(tài)平衡被破壞，導致NF-κB主要集中在細胞核內，并與DNAκB序列結合，誘導包含κB序列的基因腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細胞間黏附因子-1（ICAM-1）、環(huán)氧化酶 2（COX-2）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-6（IL-6）等的轉錄，同時新合成的IκB-α蛋白又和細胞核內的NF-κB結合，形成IκB/NF-κB復合物而恢復原來的動態(tài)平衡[3，13-15]。另一方面，TRIF通過其N末端區(qū)域內TRAF6結合序列直接與TRAF6結合，隨后TRAF6以MyD88途徑相似的方式激活TAK1；此外，TRIF又能夠通過C末端區(qū)域內的受體反應蛋白（RIP）同型作用序列與RIP1相互作用，RIP1多泛素化后與TRAF6和TAK1形成復合物，最終導致NF-κB經典通路的激活[3，16]。

研究證實，中藥復方如補陽還五湯[17]，中藥有效成分如鉤藤堿、氧化苦參堿、甘草甜素、紫草素、藁本內酯、葛根素、木犀草素、丹參酮ⅡA、黃連苷、薯蕷皂苷均能夠通過TLR4/NF-κB途徑減輕大腦中動脈阻塞（MCAO）模型中腦缺血損傷[17-28]。藁本內酯主要通過抑制TLR4內源性配體Prx6的釋放抑制TLR4/NF-κB途徑的激活，從而抑制炎癥因子TNF-α、白介素-β（IL-1β）、ICAM-1、干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-17（IL-17）mRNA的表達和缺血區(qū)域膠質細胞活化和白細胞浸潤，發(fā)揮神經保護作用。而薯蕷皂苷通過抑制HMGB-1的核移位抑制TLR4/MyD88/TRAF6/NF-κB途徑的激活，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、ICAM-1、IFN-γ、巨噬細胞炎性蛋白-α（MIP-1α）、MIP-2、IL-17、IL-23mRNA 的表達，從而發(fā)揮其保護作用；隨后通過培養(yǎng)PC12細胞和原代皮層神經元，結果相似，證明薯蕷皂苷潛在作用靶點在神經元。異槲皮素、黃芩苷均能在神經元氧糖剝奪/復氧（OGD/R）損傷條件下，通過 TLR4/NF-κB途徑抑制神經元的炎癥反應，從而發(fā)揮保護效應[29-30]。楊興旺等[31]研究紅花黃色素對小膠質細胞炎性反應通路的影響，發(fā)現(xiàn)可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路而發(fā)揮抗炎作用。

4.2 中藥通過TLR4/AP-1途徑減輕炎癥反應 TLR4通過MyD88激活IKK，同時MAPK被激活；首先，胞外信號調節(jié)激酶（ERK）誘導高遷移率蛋白TCFs磷酸化，導致c-Fos表達增加，隨后c-Fos和轉錄因子MEF2誘導c-Jun表達；由Fos蛋白中亮氨酸鏈構成的α螺旋結構和有相似結構的Jun蛋白構成的AP-1二聚體隨之增加；胞內糖原合酶激酶-3β和核糖體S6激酶2大量存在時，使Fos蛋白和Jun蛋白發(fā)生磷酸化，最終AP-1被激活，移位入核與DNA上AP-1區(qū)域結合，調控一些炎癥因子的表達，如:ICAM-1、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）[32-33]。

研究顯示，木犀草素[24-25]、藁本內酯[22]、薯蕷皂苷[28]均能夠通過TLR4/AP-1途徑減輕中腦動脈閉塞（MCAO）模型中腦缺血損傷。木犀草素主要通過TLR4/ERK、P38途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。藁本內酯主要通過Prx6/TLR4/ERK途徑發(fā)揮作用。薯蕷皂苷通過HMGB-1/TLR4/MyD88/TRAF6/MAPKs（ERK、JNK、P38）/AP-1途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷作用，隨后體外培養(yǎng)神經元進行驗證，發(fā)現(xiàn)結果相似。同樣，異槲皮素也能在神經元OGD/R損傷條件下，通過TLR4/P-38、P-JNK、P-ERK途徑抑制神經元的炎癥反應[29]。

4.3 中藥通過TLR4/IRF3途徑減輕炎癥反應 TLR4通過TRIF依賴性途徑激活IRF3，從而產生Ⅰ型IFN[3]。TLR4首先通過MyD88依賴性途徑誘導早期NF-κB和MAPK活化，隨后通過內吞途徑傳遞到細胞囊泡內，與囊泡內TRAM和TRIF組成復合物，該復合物通過募集TRAF3和TANK結合激酶1（TBK1）和IKKi，催化IRF3磷酸化，形成IRF3二聚體，移位至細胞核，最終產生Ⅰ型IFN[34]。

Waleed等[20]研究甘草甜素對MCAO小鼠的保護作用時發(fā)現(xiàn)，甘草甜素可以抑制腦缺血導致的TLR4、TRIF、IRF3mRNA表達的升高，提示甘草甜素可以通過TLR4/TRIF/IRF3途徑發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

5 總結與展望

近些年，以TLR4為靶點治療腦缺血損傷的研究備受研究者們的關注。筆者僅以TLR4在腦缺血損傷過程中的作用以及中藥的干預作以上總結，旨在為減輕腦缺血損傷基于TLR4信號轉導途徑的抗炎療法提供參考。

在TLRs家庭中，中藥的作用靶點研究主要集中于TLR4，一方面，TLR4作為TLRs家族中的基礎成員，TLR4介導的炎癥反應幾乎可以反映整個TLRs家族介導的炎癥反應發(fā)生發(fā)展的過程；另一方面，TLR4介導的炎癥反應，需要MyD88和TRIF信號通路共同參與，通過阻斷MyD88 N末端死亡結構域IRAK蛋白激酶家族成員之間的信號傳導，就可以抑制TLR4介導的炎癥反應的整個過程；因此，以TLRs為作用靶點，研究中藥抗腦缺血炎癥損傷意義重大。

通過TLR4干預腦缺血損傷的中藥有效成分主要包括:生物堿類、黃酮類、皂苷類、揮發(fā)油類。提示在今后以TLR4為靶點治療腦缺血損傷的研究中可以主要從以上4類成分中篩選出中藥活性成分。

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