快速檢測(cè)蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留方法的優(yōu)化

胡明燕 車(chē)明秀 張艷 王駿

摘要：乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法是目前監(jiān)管中應(yīng)用最為廣泛的快速篩查蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法。對(duì)該方法進(jìn)行了多項(xiàng)條件的優(yōu)化，結(jié)果表明，酶活性ΔA0控制在0.2～0.3時(shí)，抑制率能真實(shí)反映樣品陽(yáng)性結(jié)果;孵育溫度是影響結(jié)果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，比色槽溫度變化較大，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果的平行性和重現(xiàn)性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應(yīng)結(jié)果重現(xiàn)性很好;配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)將丙酮含量控制在≤1%時(shí)，丙酮對(duì)試驗(yàn)的影響可以忽略。

關(guān)鍵詞：有機(jī)磷;氨基甲酸酯;農(nóng)藥殘留快速檢測(cè);乙酰膽堿酯酶抑制-分光光度法

中圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：O656.31? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）21-0112-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.028? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

The Optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for Determination of Organophosphate and Carbamate Pesticide Residues in Vegetables

HU Ming-yan1，CHE Ming-xiu1，ZHANG Yan2，WANG Jun1

（1.Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250103，China;

2.Licheng Direct Food and Drug Administration of Jinan City，Jinan 250100，China）

Abstract： Acetylcholinesterase-spectrophotometry is the most widely used method for rapid detection of organophosphorus and carbamate pesticide residues in vegetables. However，in practical application，the method is seriously limited by numerous peripheral influencing factors and low accuracy. The optimization of Acetylcholinesterase-Spectrophotometry for determination of organophosphate and carbamate pesticide residues in vegetables were studied in this paper.Controlling the ΔA value between 0.2～0.3 and its results were given，which could improve the accuracy of positive test results. Extra thermostatic bath was chosen instead of device came with instrument and the results showed greatly improved reproducibility and parallelism. In order to avoid the influence of acetone on enzyme activity，the added amount of acetone should be controlled less than 1% when preparing standard solution.

Key words： organophosphate;carbamate pesticide residues;rapid detection;acetylcholinesterase

有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥作為一類(lèi)高效、廣譜的殺蟲(chóng)劑、除草劑等正被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，但大量使用后對(duì)人、動(dòng)物和環(huán)境產(chǎn)生的危害也日益嚴(yán)重[1]。有機(jī)磷 （OPs）及氨基甲酸酯（CBs）類(lèi)殺蟲(chóng)劑作為昆蟲(chóng)神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶的專(zhuān)一性抑制劑被篩選出來(lái)廣泛應(yīng)用，占?xì)⑾x(chóng)劑用量的70%以上[2，3]。有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)人和動(dòng)物的毒性較大，絕大多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥是劇毒的，因其可與膽堿酯酶迅速結(jié)合，形成磷脂化膽堿酯酶，使膽堿酯酶失去催化水解乙酰膽堿的能力，使乙酰膽堿在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致神經(jīng)處于過(guò)度興奮狀態(tài)而出現(xiàn)中毒癥狀[4]，而且噴灑農(nóng)藥還會(huì)造成生態(tài)環(huán)境污染[5]。農(nóng)藥的急慢性中毒，特別是果蔬食品污染后引發(fā)的群體中毒事件屢有發(fā)生[6]。因此世界各國(guó)對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留問(wèn)題均高度重視，投入大量資金、人力和物力控制有機(jī)磷農(nóng)藥相關(guān)的安全問(wèn)題。中國(guó)GB 2763-2016[7]對(duì)馬拉硫磷、毒死蜱、樂(lè)果、敵敵畏等多種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥有嚴(yán)格限量規(guī)定。

采用酶抑制法的產(chǎn)品是品種最多、應(yīng)用最為普遍的快檢技術(shù)，該類(lèi)產(chǎn)品可以有效快速檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥。另外速測(cè)卡法由于檢驗(yàn)原理同酶抑制法一致，且其操作簡(jiǎn)單、成本低廉，在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市有很高的市場(chǎng)占有率。

現(xiàn)行有效的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)僅有GB/T 5009.199-2003[8]和NY/T 448-2001[9]。上述標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方法為酶抑制法和速測(cè)卡法，但均為推薦標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)用具有局限性，導(dǎo)致國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上農(nóng)殘快速檢測(cè)產(chǎn)品品種繁多，檢測(cè)效果差強(qiáng)人意。本研究以GB/T 5009.199-2003[8]為基礎(chǔ)，優(yōu)化檢測(cè)方法，建立酶抑制法快速檢測(cè)方法，通用性強(qiáng)且檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)一準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)對(duì)蔬菜中有機(jī)磷類(lèi)和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的快速半定量分析，有效實(shí)現(xiàn)不同廠家快速檢測(cè)產(chǎn)品結(jié)果的比對(duì)，滿(mǎn)足市場(chǎng)監(jiān)督快速篩查需求。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

3種有機(jī)磷和2種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥參考物質(zhì)的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量見(jiàn)表1，純度均≥98%。

丙酮（CH3COCH3）、磷酸氫二鉀（K2HPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（C14H8N2O8S2）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、碘化乙酰硫代膽堿（C7H16INOS）。

pH 8.0緩沖溶液：分別稱(chēng)取11.9 g無(wú)水磷酸氫二鉀及3.2 g磷酸二氫鉀，溶解于1 000 mL水中，混勻。

顯色劑：分別取160 mg 5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）和15.6 mg碳酸氫鈉，用20 mL緩沖溶液溶解，4 ℃冰箱中保存。

底物：取125 mg碘化乙酰硫代膽堿，加15 mL蒸餾水溶解，搖勻后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過(guò)兩周。

乙酰膽堿酯酶4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 儀器和設(shè)備

恒溫水浴鍋、電子天平、分光光度計(jì)或相應(yīng)商品化測(cè)定儀。

1.3? 原理

在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412 nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率。

1.4? 方法

1.4.1? 試樣的提取

1）整株提取法。選取韭菜、芹菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，稱(chēng)取試樣3 g置于表面皿中，加入10 mL緩沖液，殘缺面不得接觸緩沖液，輕輕振搖50次，靜置2 min以上，取上清液備用。

2）整體測(cè)定法。選取油菜、菠菜等有代表性的樣品，擦去表面泥土，剪成1 cm左右見(jiàn)方碎片，稱(chēng)取3 g放入離心管中，加入10 mL緩沖溶液，振搖50次，靜置2 min以上，倒出提取液，靜置3～5 min，待用。

1.4.2? 對(duì)照液的測(cè)定? 先于反應(yīng)管中加入3 mL緩沖溶液，再加入適量酶液、0.1 mL顯色劑，搖勻后于37 ℃水浴鍋中放置15 min。加入0.1 mL底物搖勻，立即測(cè)吸光度，3 min后再測(cè)定1次，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化ΔA0。

1.4.3? 樣品液的測(cè)定? 先于反應(yīng)管中加入3 mL提取液，其他操作與對(duì)照液操作相同，記錄反應(yīng)3 min的吸光度的變化ΔAt。

1.4.4? 結(jié)果判定

結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。

式中，ΔA0為對(duì)照溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值;ΔAt為樣品溶液反應(yīng)3 min吸光度的變化值。

當(dāng)抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留高于檢測(cè)限，判定為陽(yáng)性，陽(yáng)性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗(yàn)2次以上。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)采用其他分析方法進(jìn)行確證，進(jìn)一步確定農(nóng)藥品種和含量。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 乙酰膽堿酯酶ΔA0的優(yōu)化

酶抑制法的結(jié)果是樣品溶液與對(duì)照溶液ΔA0的比值，因此，ΔA0對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響較大。對(duì)照溶液ΔA0的變化值過(guò)大或過(guò)小，有可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。為了考察ΔA0大小對(duì)酶抑制率的影響，本研究對(duì)比了ΔA0變化對(duì)陽(yáng)性樣本的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，僅ΔA0控制在0.2～0.3時(shí)，抑制率能真實(shí)反映樣品陽(yáng)性結(jié)果，其余均為假陰性結(jié)果。

2.2? 恒溫裝置的選擇

孵育溫度是影響結(jié)果精密度的重要因素，部分儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，為了考察不同恒溫裝置對(duì)反應(yīng)的影響，本研究對(duì)比了空白溶液在儀器自帶恒溫裝置和恒溫水浴鍋中的反應(yīng)效果。由表3可知，自帶恒溫裝置的吸光度相差較大，方差達(dá)到0.038，變化起伏超過(guò)平均值的16%，而使用恒溫水浴裝置的平行樣品吸光度差距不大，方差僅為0.002。研究發(fā)現(xiàn)儀器自帶恒溫裝置的溫控穩(wěn)定性較差，比色槽溫度變化較大，導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)果的重現(xiàn)性較差，試樣在恒溫水浴鍋中的反應(yīng)結(jié)果重現(xiàn)性很好，因此將恒溫水浴鍋用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.3? 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試液的選擇

對(duì)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)每種農(nóng)藥都微溶于水，易溶于丙酮，考慮到丙酮的用量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有一定影響。因此，本研究用丙酮溶解標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，在對(duì)照溶液中添加丙酮使其含量分別為100%、10%、5%、1%、0%，測(cè)定反應(yīng)體系反應(yīng)3 min后的吸光度變化值ΔA，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可以看出，隨著體系中丙酮含量的增加，反應(yīng)體系反應(yīng)3 min后的吸光度不斷降低，表明丙酮能夠抑制酶促反應(yīng)的進(jìn)行，從而影響酶抑制率法測(cè)定蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的結(jié)果。丙酮含量≤1%時(shí)，幾乎對(duì)酶促反應(yīng)沒(méi)有影響，因此，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，應(yīng)將丙酮的含量控制在≤1%的范圍里。

2.4? 優(yōu)化后方法的評(píng)價(jià)

采用優(yōu)化后的方法由3家不同的機(jī)構(gòu)對(duì)5種商品化的試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，品牌A和品牌B兩種試劑盒的驗(yàn)證結(jié)果性能優(yōu)異，各項(xiàng)性能指標(biāo)完全符合國(guó)家食藥總局發(fā)布的《食品快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科〔2017〕43號(hào)）[10]的相關(guān)要求;其他3個(gè)品牌由于試劑盒質(zhì)量的原因，性能指標(biāo)不能達(dá)到國(guó)家規(guī)定的要求。

3? 討論

由于該方法在目前的監(jiān)管工作中應(yīng)用非常廣泛，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)產(chǎn)品在國(guó)家總局統(tǒng)計(jì)的采購(gòu)量中占30%以上，主要用于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市、批發(fā)市場(chǎng)等流通領(lǐng)域中蔬菜和水果的快速篩查。另外由于目前市場(chǎng)上商品化快檢試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，建議應(yīng)用A類(lèi)和B類(lèi)快檢產(chǎn)品對(duì)其性能指標(biāo)進(jìn)行考察評(píng)價(jià)，符合該方法性能指標(biāo)和評(píng)價(jià)準(zhǔn)則各項(xiàng)要求后方可使用。

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