湖北省桑椹腐爛病病原菌鑒定

周建華 朱志賢 李勇 莫榮利 于翠 胡興明 鄧文

摘要：為明確引起桑椹腐爛病的病原菌種類，2017年從湖北省采集病果，采用常規組織分離法進行分離，用分離純化的菌株進行菌絲塊針刺和孢子液注射接種健康果均可致病，形態學鑒定發現其形態學特征與灰霉菌（Botrytis cinerea）一致。在 GenBank進行Blast比對，該菌株的rDNA-ITS序列與Botrytis cinerea和Botrytis fabae相似率最高為99%，用區分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性引物進行檢測，同時構建分子系統進化樹進行分子生物學鑒定，進一步表明該菌為Botrytis cinerea。致病性測定、形態學及分子生物學鑒定結果表明，引起湖北省桑椹腐爛病的病原菌為Botrytis cinerea。

關鍵詞：桑椹腐爛病;致病性測定;形態學鑒定;系統進化樹

中圖分類號：S663.9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）21-0069-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.21.016? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification of Fruit Rot Pathogen on Mulberry in Hubei Province

ZHOU Jian-huaa，ZHU Zhi-xianb，LI Yongb，MO Rong-lib，YU Cuib，HU Xing-mingb，DENG Wenb

（a.Industry Department/Hubei Sericulture Engineering Technology Research Center;

b.Institute of Economic Crops，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

Abstract： In order to understand pathogens associate with mulberry rot disease，fruit with rot symptoms were collected from Hubei province in 2017，and the conventional tissue separation method was used to obtain the isolates. Healthy fruits inoculated with purified strain by mycelium plugs puncture and conidia injection both can cause diseased symptoms. Morphological identification showed that the morphological features of the strain were similar to Botrytis cinerea. The Blast search of rDNA ITS sequence of the strain showed 99% sequence identity with Botrytis cinerea and Botrytis fabae in GenBank. The specific primers were used for distinguish Botrytis cinerea and Botrytis fabae，and the construction of molecular phylogenetic tree further confirm the strain was Botrytis cinerea. The results of pathogenicity test，morphological and molecular identification indicated that the pathogen of mulberry rot in Hubei province was Botrytis cinerea.

Key words： mulberry rot;pathogenicity test;morphological identification;phylogenetic tree

桑樹是多年生經濟植物，在亞洲、歐洲、美洲和非洲廣泛種植，過去被用于絲綢產業，但近10多年來，隨著桑椹食品與保健品加工技術、生產工藝的發展，以及桑椹采摘游的興起，以生產桑椹為主要目的的果桑產業快速發展，全國果桑種植面積也不斷增加，據不完全統計全國的果桑種植面積達5.33萬hm2，桑果產量近80萬t[1]。隨著種植面積的擴大，病害問題日益突出，極大地影響了桑椹的產量和品質。

湖北省是全國農業區劃確定的桑蠶最適宜區域，有4 000多年栽桑養蠶的歷史，是全國蠶桑十大省份之一[2]，武漢市、赤壁市、黃岡市、英山縣、洪湖市、宜都市等地都建立了果桑基地，果桑規模逐年擴大。在2017年調查中發現，除桑椹菌核病外，桑椹果肉腐爛病發生普遍，發病率5%～20%，病椹初期出現淺褐色病斑，病斑擴展后呈現深褐色水漬狀，桑椹小漿果逐漸腐爛，最后整個病椹脫落。為了明確該病的病原，本研究對該病害的病原菌進行了分離、鑒定和致病性測定，以期為病害防治提供理論依據。

1? 材料和方法

1.1? 病原菌的分離與保存

2017年從湖北省采集發病病果，將發病小核果在75%乙醇中浸泡30 s，在4%次氯酸鈉溶液中浸泡1 min，然后用滅菌水漂洗3次，將小核果置于PDA平板上（2%葡萄糖、1.5%瓊脂粉，每升培養基加20滴25%的乳酸），于25 ℃恒溫培養箱中黑暗培養。然后將分離物轉移至新鮮的PDA平板純化，將純化的菌株用濾紙片保存于-20 ℃冰箱中保存備用。

1.2? 菌株致病性測定

菌絲塊致病性測定。將分離純化的菌株在PDA平板上25 ℃條件下暗培養10 d。用直徑6 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌絲塊，用無菌注射器針刺花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），將菌絲塊置于針刺部位。然后置于鋪有3層滅菌吸水紙的9 cm玻璃皿中，25 ℃條件下黑暗培養，每隔1 d觀察1次發病情況，以針刺接種PDA培養基的桑椹為試驗對照，試驗重復3次，每個重復3顆桑椹。待桑椹顯現出明顯的癥狀后進行再分離，觀察再分離的菌株與原接種菌株在相同培養條件下的形態學特征，進行柯赫氏法則驗證。

分生孢子液致病性測定。將分離純化的菌株在PDA平板上25 ℃條件下黑暗培養10 d。用無菌水清洗菌落，4層擦鏡紙過濾分生孢子，8 000 r/min離心5 min，去上清液，用無菌水將孢子濃度調整成1×105個/mL。用無菌注射器吸取100 μL分生孢子懸浮液注射接種花期桑椹（75%乙醇，消毒30 s），以接種無菌水的桑椹為試驗對照，后續操作步驟同菌絲塊致病性測定。

1.3? 形態學鑒定

將保存的代表菌株接種于PDA平板上進行活化，置于25 ℃的恒溫箱中暗培養3 d后，用直徑6 mm滅菌打孔器打取菌落邊緣菌絲塊，將其轉至新的PDA平板上，25 ℃的恒溫箱中黑暗培養，設5次重復，分別于3、5 d測量菌落直徑。根據菌落直徑計算菌絲生長速度，計算公式：菌絲生長速度（mm/d）=（5 d菌落直徑-3 d菌落直徑）/2。觀察菌株形態、色澤以及是否產生孢子和菌核，在光學顯微鏡下（Leica，DM500）觀察分生孢子形狀，并測量其大小。

1.4? 分子生物學鑒定

1.4.1? 基因組DNA提取? 將菌株轉入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央培養，25 ℃條件下培養7 d后收集菌絲。采用CTAB法提取病菌基因組DNA[3]，具體步驟如下：①將供試菌株轉入鋪有滅菌玻璃紙的PDA平板中央，25 ℃培養5 d后刮取菌絲。將菌絲在液氨中研磨成粉末狀，放入1.5 mL EP管中，往EP管中加入65 ℃預熱好的CTAB提取緩沖液（2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl）600 μL，混勻后置于水浴鍋65 ℃水浴30 min，中間混勻1～2次;②加入600 μL氯仿/異戊醇（24∶1）混勻，12 000 r/min離心10 min;取上清液，重復1次;③2次沉淀后取上清液，加入無水乙醇1.2 mL，在-20 ℃沉淀30 min，12 000 r/min離心10 min;④沉淀用70%乙醇洗2遍，37 ℃風干1 h，溶于50 μL去離子水中，置于-20 ℃保存備用。

1.4.2? rDNA-ITS區的PCR擴增? 利用真菌核糖體基因轉錄間隔區引物對ITS1（5′-TCCGTAGGTGAAC

CTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC

-3′）作為序列擴增和測序引物[4]，引物均由擎科生物科技有限公司合成。PCR反應為總體積50 μL體系，包括2×Es Taq Mastermix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板DNA 50 ng 1 μL，加入ddH2O至體系體積達50 μL。將配好的PCR體系在Ti-PCR儀（美國Bio-Rad公司，S1000TMThermal Cycler）上進行擴增。ITS 擴增程序：95 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物5 μL與2 μL 6×loading buffer混合（含1‰SYBR GreenI核酸染料，北京百泰克生物技術有限公司），經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像（美國Bio-Rad公司，Gel DocTMXR+）下檢查擴增結果，并委托擎科生物科技有限公司進行DNA純化和測序。

1.4.3? 特異性引物檢測? 用區分灰霉菌（Botrytis cinerea）和蠶豆葡萄孢（Botrytis fabae）PCR引物（C729+/-：AGCTCGAGAGAGATCTCTGA/CTGCAA TGTTCTGCGTGGAA）[5，6]來對形態學鑒定的菌株進行驗證。擴增體系同ITS擴增體系，擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環;72 ℃延伸10 min。

1.4.4? 系統發育分析? 將供試菌株ITS測序結果在DNAMAN軟件（Version 5.2.2）中校對拼接后，將測序的DNA序列提交給GenBank，獲得登錄號。將DNA序列與GenBank數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）中的序列進行比對，選取與其同源性高的序列，采用CLUSTALX（Version 1.83）對序列片段進行比對（alignment）[7]，設定參數。多重序列比對參數：起始空位罰分（gap opening）=10，延伸空位罰分（extension opening）=0.2，轉移權系數（transition weight）=0.5，延遲發散序列（delay divergent sequences）=30%。根據需要對結果進行校對[8]。比對后采用MEGA 5.05軟件中的最大似然法構建系統進化樹，選用Kimura 2 parameter（K2P） substitution模型，進化樹用自展分析法進行檢驗，循環1 000次。

2? 結果與分析

2.1? 病原菌分離、純化和保存

2017年從湖北省發生危害嚴重的果桑基地采集了20份桑椹腐爛病樣品（圖1），采用常規組織分離法進行分離，均能分離出灰霉屬真菌且形態相似。將分離的菌株移至新鮮的PDA平板純化，用濾紙片法保存于-20 ℃冰箱。以Bg2為代表菌株進行鑒定，本研究中涉及到病原菌的所有試驗，均使用該菌株。

2.2? 致病性測定

菌絲塊和分生孢子液致病性測定結果表明，2種接種方法均可引起桑椹腐爛病發生，接種第3 d可觀察到病斑，小核果病斑初期為淺褐色，后期為水漬狀深褐色。分生孢子液接種比菌絲塊接種發病快，第5天時，菌絲塊接種的桑果僅少數小核果變褐腐爛（圖2A），而分生孢子液接種的桑椹整顆腐爛，花梗也全部腐爛，在病椹周圍形成白色霉層（圖2B）。

2.3? 病原菌形態學鑒定

Bg2菌株在PDA上菌落呈放射狀，中等氣生菌絲，4～5 d后菌落四周產生大量分生孢子，呈深灰褐色（圖3A、B、C）;后期產生大量微菌核。菌核黑色，圓形、球形或不規則的形狀（1.0～5.8） mm×（1.0～4.0） mm。分生孢子聚生于膨大的產孢細胞上（圖3D），無隔膜，橢圓形或卵圓形，（3～11.8） μm×（2.2～6.8） μm。培養性狀和形態特征與參考文獻[9]比對，將病原菌鑒定為灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers. ex Fr.）。

2.4? 分子生物學鑒定

2.4.1? ITS 區序列分析? 使用真菌ITS區域的引物ITS1和ITS4，對病原菌Bg2進行擴增，獲得長度為521 bp的片段，將測序的DNA序列上傳到GenBank上（MF445059），測序結果與GenBank NR數據庫比對后發現與Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性達99%。

2.4.2? 特異性引物檢測? 用區分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性PCR引物（C729+/-）對形態學鑒定為Botrytis cinerea的菌株進行PCR檢測，出現特異性擴增的700 bp條帶，陰性對照不擴增（圖4）。

2.4.3? 系統發育分析? 在數據庫中選取與Botrytis cinerea（MF445059）相近的代表性菌株序列用Clustal X（Version 1.83）進行多序列比對，用 MEGA 5.05軟件構建系統進化樹，結果表明該菌株與Botrytis cinerea聚為一類（圖5）。

3? 討論

根據致病性測定、形態學特征、分子生物學分析結果，將引起桑椹腐爛病的病原菌鑒定為Botrytis cinerea。灰霉病菌寄主廣泛，可危害400多種植物[9]，Martinez等[10]報道灰霉病菌種內培養形狀變異較大，具有豐富的多樣性。張靜[11]對湖北省灰霉病病菌區系和灰葡萄孢菌多樣性研究發現，不同地區或者同一地區不同的分離物，不同寄主或者同一寄主的不同部位所獲得的灰霉菌菌株的形態存在很大差異。桑椹腐爛病菌是否存在形態學差異及遺傳變異還需多收集更多病樣材料進行分離鑒定。

在形態學鑒定的基礎上，將桑椹腐爛病菌ITS測序結果與GenBank NR數據庫比對后發現，與Botrytis cinerea和Botrytis fabae的序列同源性最高，相似性達99%。Botrytis cinerea和Botrytis fabae形態學差異小，主要區別是菌核及分生孢子大小[5，12]，同時由于灰霉病菌形態學特征受環境和培養條件的影響，所以本研究采用區分Botrytis cinerea和Botrytis fabae的特異性引物（C729+/-）進行PCR驗證，該引物擴增Botrytis cinerea產生700 bp大小的條帶，而擴增Botrytis fabae會產生600 bp的條帶[6]。用該引物對桑椹腐爛病菌進行PCR擴增，同時構建ITS系統進化樹進行分子驗證，發現該引物只擴增出700 bp的條帶，分子系統進化樹與Botrytis cinerea聚為一類，分子生物學鑒定進一步說明桑椹腐爛病菌為Botrytis cinerea。

雖然在《臺灣產菌類調查報告》的灰霉菌（Botrytis cinerea） 寄主目錄中曾提到該病菌寄生于桑樹，也有報道桑樹灰霉病會造成桑樹葉部病害[13];王澤林等[14]報道桑灰霉病主要分布于四川、浙江等蠶區，以四川蠶區發病較重。該病主要在春季發生，為害桑樹的新梢、葉片、雄花和桑椹，對桑葉產質量的影響較大;韓蓓蓓[15]從采后腐爛桑椹上分離真菌獲得葡萄孢屬（Botrytis spp.）霉菌;但是本研究首次分離鑒定了引起桑椹生長期腐爛病的病原菌為Botrytis cinerea。

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