慢性牙周炎患者齦下菌斑宏轉(zhuǎn)錄組菌種分類以及相關(guān)代謝基因表達(dá)

張龍，張保榮

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053；2.航空總醫(yī)院口腔診療中心，北京100002)

牙周炎是口腔常見(jiàn)疾病之一，在普通人群中具有較高的發(fā)病率。根據(jù)不同流行病學(xué)調(diào)查顯示，在普通人群中發(fā)病率為80%～90%[1-2]。而慢性牙周炎因其牙槽骨的嚴(yán)重吸收，造成牙齒動(dòng)度的增加，已成為人類牙齒缺失的首要原因。因此對(duì)于慢性牙周炎病因的關(guān)注，一直以來(lái)是牙周病學(xué)的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)意義上牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與多種因素相關(guān)，比如菌斑、抽煙、遺傳、口腔衛(wèi)生習(xí)慣等[3-5]，而牙菌斑作為牙周炎的始動(dòng)因子，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，發(fā)揮了不可替代的重要作用。自一百多年以來(lái)，隨著各種新的微生物培養(yǎng)技術(shù)和生化技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)牙菌斑在牙周炎發(fā)病中的作用，有了不斷深入的認(rèn)識(shí)，但是采用的傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，均無(wú)法證明其中的一種或多種細(xì)菌為牙周炎的明確致病菌。傳統(tǒng)方法對(duì)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物，以及其對(duì)人體代謝的影響均基于體外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與相關(guān)的生理生化實(shí)驗(yàn)[6-7]。而對(duì)處于牙周炎疾病過(guò)程的菌群變化及其基因表達(dá)及代謝產(chǎn)物的分析，受到實(shí)驗(yàn)條件以及技術(shù)手段限制成為牙周炎病因研究的難點(diǎn)。因此，對(duì)于牙菌斑及其細(xì)菌及代謝產(chǎn)物在牙周炎發(fā)病過(guò)程中的處于疾病狀態(tài)時(shí)變化，是探究牙周炎病因的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用基于二代測(cè)序技術(shù)的對(duì)慢性牙周炎患者齦下菌斑的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，首次將齦下菌斑微環(huán)境中的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組作為研究對(duì)象，從轉(zhuǎn)錄組學(xué)的高度對(duì)慢性牙周炎的病因進(jìn)行了探討，為新一代測(cè)序技術(shù)在慢性牙周炎病因?qū)W的研究應(yīng)用提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 牙菌斑及炎性組織的采集選取航空總醫(yī)院口腔診療中心2015年3月至2016年12月收集的20例慢性牙周炎患者為觀察對(duì)象，采集齦下菌斑樣本采樣部位，對(duì)所有患者進(jìn)行牙周炎的程度進(jìn)行評(píng)估：探診深度、牙周袋深度、附著喪失程度和探針出血情況[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：3個(gè)月內(nèi)無(wú)牙周病治療史，無(wú)抗生素藥物服用或其他抗炎藥物服用，無(wú)吸煙史，無(wú)全身性疾病(糖尿病等)，婦女無(wú)妊娠，全口牙存留不少于16顆，每個(gè)區(qū)都有存留牙且至少有一個(gè)位點(diǎn)的牙周袋深度大于4 mm。所有患者知情同意。采樣前囑患者漱口，用棉簽去掉齦上菌斑干擾。每個(gè)牙齒均取6個(gè)位點(diǎn)[9]。每個(gè)樣品均溶于1.5 mL HANK液，立即進(jìn)行-80℃冷凍。

1.2 主要儀器及試劑RNeasy mini kit RNA提取試劑盒(QIAGEN公司)、Illumina HiSeqTM2000(深圳華大)Agilent 2100(安捷倫科技公司上海)Hanks液(北京諾博萊德)干冰若干、冰盒、高速離心機(jī)(Thermo Scientific公司，法國(guó))。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序前準(zhǔn)備

1.3.1 總RNA的提取采用QIAGEN公司的RNeasyMiniKitRNA提取試劑盒。配置所需的了裂解體系Buffer-RLT 500 μL，5 μL B-球基乙醇。取100 μL預(yù)處理樣品混勻。樣品預(yù)處理：4℃下解凍，3 min 12 000 r/min離心。取上清液。對(duì)于炎性組織則采用液氮研磨后，取上清液。加1:1 70%乙醇洗脫裂解液。12000 r/min 15 s再加入700 μL的Buffer-RW1洗脫。700 μL Buffer-RWE洗脫乙醇(兩遍):600 μL RNA-free水洗脫后靜置2 min，室溫下12 000 r/min、離心2 min。

1.3.2 提取后的RNA濃度將提取后的RNA送交華大基因公司進(jìn)行上機(jī)前提取RNA質(zhì)量檢測(cè)評(píng)估。提取RNA總量為0.2032～1.3759 μg，RIN值為2.2～2.9，總體符合RNA建庫(kù)要求[10]。

1.4 上機(jī)測(cè)序及建庫(kù)采用深圳華大基因的Illumina HiSeqTM2000進(jìn)行測(cè)序建庫(kù)[11]。

1.5 測(cè)序后數(shù)據(jù)處理去除含N的堿基數(shù)目總和達(dá)到一定比例的短序列(默認(rèn)10%，設(shè)置為10%)；去除拼接接頭污染(默認(rèn)接頭序列與所得序列有15 bp的重疊(設(shè)置為15 bp)；去除連續(xù)低質(zhì)量值堿基數(shù)達(dá)到一定長(zhǎng)度的序列(默認(rèn)是序列中小于Q20的堿基數(shù)目小于20%，設(shè)置為84，20%)：宿主相關(guān)RNA的去除，將所得原始數(shù)據(jù)用BLAST軟件比對(duì)到NCBI的人基因組Nonredundant Database(NR)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[12]去除人相關(guān)RNA基因(一致性為90%的前提條件下，與宿主比對(duì)上的序列被認(rèn)為是宿主序列。具體參數(shù)設(shè)置為：r:1/l:35/M:4/p:2)。所得總的測(cè)序可用數(shù)據(jù)為569782640～8751961080 bp。符合后期分析所需數(shù)據(jù)要求[13]。

1.6 序列的組裝對(duì)所得短序列，采用Trinty組裝，所得Trinty組裝結(jié)果我們稱之基因序列。組裝得到的基因序列，首先使用Tgicl將其去冗余和進(jìn)一步拼接，然后再對(duì)這些序列進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類，得到最終的非冗余基因序列(Unigene)。可以看出在不同樣品中300 bp長(zhǎng)度的Unigene數(shù)量最多分布范圍為2 018～12 906 bp。不同樣品組裝得到的Unigene聚類軟件做進(jìn)一步序列拼接，去冗余處理以及同源轉(zhuǎn)錄本聚類，得到盡可能長(zhǎng)的合并非冗余基因序列(merge-Unigene)。在進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類以后，merge-Unigene分為兩部分，一部分是簇merge-Unigene(clusters)，同一個(gè)clusters里面有若干條相似度高(大于70%)的merge-Unigene(以CL開(kāi)頭，CL后面接基因家族的編號(hào))；其余的是單獨(dú)merge-Unigene(以Unigene開(kāi)頭)，代表單獨(dú)的Unigene。

1.7 基因功能注釋基因功能注釋主要基于氨基酸序列比對(duì)。將基因的氨基酸序列與各數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到對(duì)應(yīng)的功能注釋信息。由于每一條序列比對(duì)結(jié)果超過(guò)一條，為保證其生物意義，保留一條最優(yōu)比對(duì)結(jié)果作為該基因的注釋。所有的注釋均使用BLAST(version 2.2.21)軟件結(jié)合各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)完成。主要采用數(shù)據(jù)庫(kù)有：Nonredundant Database(NR):Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)[14-16]；Version：59 Carbohydrate-Active Enzymes Database(CAZy)[17]；Cluster of Orthologous Groups of proteins(COG)。

2 結(jié)果

2.1 慢性牙周炎患者齦下菌斑細(xì)菌種類和數(shù)量主要細(xì)菌為7種：文氏密螺旋體占12.4%、齒垢螺旋體占3.6%、牙齦二氧化碳噬纖維菌占2.8%、牙髓卟啉單胞菌占2.6%、普雷沃菌占2.6%、梅毒螺旋體占2.1%、中間普氏菌占2.0%，而螺旋體占28.1%。

2.2 基于COG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋對(duì)比COG中二十五大類功能，與之有比對(duì)功能的序列涵蓋了其中24種。其中含量最為豐富的是與細(xì)菌翻譯相關(guān)的過(guò)程，有超過(guò)5 000條merge-unigene，見(jiàn)圖1。

圖1 COG數(shù)據(jù)庫(kù)merge-unigene功能分析

2.3 基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋將merge-Unigene BLAST到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，得到與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝通路相關(guān)的merge-Unigene分布情況。在所有樣品中主要與之相關(guān)的代謝通路為氨基酸的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝相關(guān)。其中數(shù)量最多的基因數(shù)量集中于精氨酸、脯氨酸代謝通路上，有1 149條merge-Unigene與之相關(guān)，見(jiàn)圖2。

圖2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)與氨基酸代謝通路有關(guān)的merge-unigene功能

2.4 基于糖類活性酶(carbohydrate-Active Enzymes Database，CAZy)的功能注釋merge-Unigene最多的兩類碳水化合物酶：碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)?3、糖苷水解酶為34、糖苷轉(zhuǎn)移酶為17、碳水化合物酯酶為4，但是與多糖裂解酶相關(guān)的merge-unigene數(shù)量為0。

3 討論

慢性牙周炎患者齦下菌斑轉(zhuǎn)錄組分析可以看出，在慢性牙周炎患者的齦下菌斑中，傳統(tǒng)意義上致病力較弱的螺旋體其基因表達(dá)最多，而通常意義上與牙周炎關(guān)系密切的牙齦卟啉單胞菌基因表達(dá)并不明顯。提示了傳統(tǒng)方法對(duì)于慢性牙周炎的研究有其自身的局限性和不足之處，而通常意義上在研究細(xì)菌基因時(shí)多關(guān)注在DNA層面[18]，忽視了RNA水平上基因表達(dá)差異的變化。本實(shí)驗(yàn)首次抽取齦下菌斑RNA進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，而這個(gè)可能為我們解釋微量或者低致病性細(xì)菌對(duì)牙周炎的發(fā)生提出新的認(rèn)識(shí)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明：(1)慢性牙周炎患者齦下菌斑中螺旋體的RNA含量最高，表明螺旋體在牙周炎的疾病過(guò)程中基因表達(dá)會(huì)較其他細(xì)菌較多。這與我們通常意義上的牙周炎致病菌認(rèn)識(shí)是不同的[19]。(2)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)，與不同的蛋白庫(kù)比對(duì)，筆者在整個(gè)轉(zhuǎn)錄組高度上發(fā)現(xiàn)了牙菌斑作為一個(gè)整體，在牙周炎的發(fā)病過(guò)程中與其細(xì)菌基本生理活動(dòng)以及牙菌斑生理代謝過(guò)程及通路相關(guān)基因的表達(dá)情況，并且通過(guò)與碳水化合物活性酶相關(guān)基因比對(duì)，發(fā)現(xiàn)齦下菌斑中細(xì)菌整體不能利用多糖，但可以通過(guò)糖苷水解酶利用單糖及其他雙糖等碳水化合物提供強(qiáng)有力的證據(jù)[20]。證明單純的食物殘?jiān)M(jìn)入齦下菌斑，并不能對(duì)牙周炎產(chǎn)生致病性。

綜上所述，基于高通量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析能為筆者對(duì)齦下菌斑致病性的研究提供新思路，并且補(bǔ)充了許多傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)局限帶來(lái)的對(duì)牙周炎認(rèn)識(shí)的不足之處。提示在牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，螺旋體的基因高表達(dá)為牙周炎的發(fā)生發(fā)展起了推動(dòng)作用。

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