乳腺浸潤性導管癌TOP2A基因狀態與HER2及臨床病理特征的關系

趙麗輝，易冰，孟鳳嬌

（中山市人民醫院1.分子診斷中心，2.病理科，廣東 中山528403）

乳腺癌發病率以每年5%的速度增長，且呈年輕化、低齡化[1－3]。目前乳腺癌的治療除手術外，還包括激素治療、化療和靶向治療；蒽環類藥物在化療方案中具有重要作用，但有效率僅為25% ～30%[4－5]。DNA拓撲異構酶Ⅱα（topoisomeraseⅡalpha，TOP2A）是常見的化療療效預測因子，其擴增或缺失與蒽環類藥物的反應性之間具有相關性[6－7]。研究發現[8]，蒽環類藥物作用于TOP2a蛋白，產生細胞毒作用，誘導細胞凋亡，但同時具有嚴重的毒副作用。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是乳腺癌發生發展的驅動基因，也是臨床預后重要的指標之一，其與TOP2A在乳腺癌中的表達具有一定相關性[9]。有分析指出，TOP2A基因擴增時不伴HER2基因擴增極為罕見。研究表明，當不存在HER2/neu型基因時，很大一部分乳腺癌患者會出現TOP2A基因擴增或過表達[10－11]。因此，本文擬通過熒光原位雜交法（FISH）檢測371例乳腺浸潤性導管癌患者TOP2A基因，分析其基因狀態與HER2基因、HER2蛋白表達及臨床病理特征之間的相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象

篩選收集2015年7月至2017年5月于中山市人民醫院乳腺外科就診的乳腺浸潤性導管癌患者371例。其中，男3例，女368例；年齡25～86歲，≥50歲191例，＜50歲180例；乳腺手術切除116例，B超引導下乳腺腫塊穿刺活檢255例；左乳190例，右乳181例。

所有患者手術及穿刺前均未行放療、化療或分子靶向治療。手術及穿刺標本均按常規行10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片及HE染色，由病理科醫師閱片確診為浸潤性導管癌。本研究所涉及的相關病理檢測均獲得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器

FISH檢測GLP TOP2A/GSP 17探針試劑盒購自廣州安必平生物技術有限公司；ThermoBrite S500-24熒光原位雜交儀（美國Abbott公司）；BX51熒光顯微鏡，JENOPTIK攝像頭及FISH分析軟件（日本Olympus公司）。雙色銀染原位雜交法（DISH）檢測試劑包括Inform HER-2/CEP17 DNA雙探針、Ultra-View SISH DNP檢測試劑盒、UltraViewRed ISH DIG檢測試劑盒以及輔助試劑均為瑞士羅氏Ventana公司產品；免疫組織化學（IHC）檢測試劑購自福州邁新生物技術有限公司；BenchMark XT全自動免疫組化染色儀（瑞士羅氏Ventana公司）。

1.3 方法

1.3.1 FISH檢測TOP2A基因狀態 3～4μm連續石蠟切片，貼至涂膠片上，65℃恒溫箱烤片過夜；二甲苯脫蠟2次，每次15 min；無水乙醇脫蠟10 min；梯度乙醇（100%、95%、80%、70%）脫水各 3 min至去離子水；100℃煮片25 min；晾干后胃蛋白酶37℃恒溫消化3～10 min；2×SSC緩沖液洗片2次，每次5 min；梯度乙醇（70%、80%、95%、100%）脫水各3 min，自然晾干；滴加TOP2A雜交液，封片，在雜交儀上變性雜交10～18 h，2×SSC與0.1%NP-40洗液洗去多余雜交液；滴加DAPI復染劑于熒光顯微鏡下觀察計數。檢測前需通過HE染色切片定位腫瘤浸潤區域。

1.3.2 DISH檢測HER2基因狀態 3～4μm石蠟切片，65℃恒溫箱烤片1～2 h，置于BenchMark XT全自動免疫組化染色機，放入DISH檢測試劑進行檢測，具體按操作試劑盒說明書進行。結束后取片，用含清潔劑的清水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以腫瘤周邊的間質成纖維細胞、內皮細胞、淋巴細胞以及其他非腫瘤細胞作為自身內對照。

1.3.3 IHC檢測 HER2蛋白表達 2～3μm石蠟切片，65℃恒溫箱烤片1～2 h，將切片置于Bench-Mark XT全自動免疫組化染色機，放入DAB試劑盒、蘇木素、返藍液，一抗為 HER2/NEU（4B5）單克隆抗體，具體操作步驟嚴格按羅氏診斷優化程序執行。結束后取片，用含清潔劑的清水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。陰性對照為同一切片中正常導管上皮，陽性對照選取HER2（2＋）并經FISH檢測證實的乳腺癌病例。

1.3.4 結果判讀 FISH結果判讀的具體方法參照文獻[12－13]；DISH檢測結果判讀參照2013年ASCO/CAPHER2指南[13]；IHC：參照乳腺癌 HER2檢測指南（2014版），均以浸潤癌細胞為觀察目標，無著色或≤10%癌細胞微弱膜著色為（0）；≥10%癌細胞微弱膜著色為（1＋）；10%癌細胞不完整和（或）中等強度膜著色，或≤10%癌細胞強而完整的膜著色為（2＋）；＞10%癌細胞強而完整的膜著色為（3＋）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 11.0軟件進行統計學分析，各變量之間的關系采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TOP2A基因狀態與HER2的相關性

由表1可見，371例患者中TOP2A基因擴增64例，缺失 12例，總異常率為 20.49%（76/371），無擴增或缺失295例；HER2基因擴增122例（32.88%，122/371），高于TOP2A基因擴增；TOP2A基因與HER2基因共擴增53例；12例TOP2A基因缺失中有9例HER2基因擴增，295例TOP2A基因無擴增或缺失中有60例HER2基因擴增。統計分析顯示，TOP2A基因狀態與HER2基因明顯相關（P＜0.05）。TOP2A基因擴增率隨HER2蛋白表達增強而增高（P＜0.05），TOP2A基因狀態與HER2蛋白表達明顯相關（P＜0.05）。乳腺浸潤性導管癌基因TOP2A和HER2基因狀態及 HER2蛋白表達見圖1。

表1 TOP2A基因與HER2基因及HER2蛋白表達的關系 例（%）

圖1 乳腺浸潤性導管癌基因狀態及蛋白表達

2.2 TOP2A基因異常與臨床病理特征的關系

由表2可見，TOP2A基因狀態與年齡、部位及有無淋巴結轉移均無相關性（P＞0.05）；男性異常率高于女性，但差異無統計學意義（P＞0.05）；Ⅰ級異常率最低（3.03%），Ⅲ級異常率最高（30.91%），TOP2A基因狀態與病理組織學分級相關（P＜0.05）；TOP2A基因異常中伴有高級別導管原位癌的病例高于伴中、低級別導管原位癌的病例，但差異無統計學意義（P＞0.05）；腫瘤直徑為 2～5 cm時TOP2A基因擴增和缺失率較高，腫瘤直徑與TOP2A基因狀態相關（P＜0.05）。

3 討論

TOP2A基因是核基質成分之一，在核內發揮作用[14]。TOP2A作為調節核酸空間結構動態變化、控制核酸生理功能的關鍵酶，在多種細胞中均有表達，且在增殖細胞中呈周期性特異表達。TOP2A在腫瘤細胞的不同周期表達各異，一般表現為在DNA復制后期及有絲分裂期表達增加，有絲分裂期結束后表達有所下降，提示腫瘤增殖受TOP2A表達影響[15]。TOP2A基因參與乳腺癌細胞的復制，存在TOP2A基因異常的患者預后差，無復發生存期縮短，尤其是TOP2A基因缺失的患者預后更差。基因擴增提示腫瘤有復發的可能，或者遠期的療效下降。因此，正確檢測和評定乳腺癌中TOP2A狀態至關重要。

表2 TOP2A基因與臨床病理特征的關系 例（%）

TOP2A變異有兩種表現形式，分別是TOP2A基因拷貝數（判斷擴增與否）和TOP2AmRNA表達。國外有文獻報道，乳腺癌TOP2A基因擴增率為23.9%，基因缺失率為2.8%[16]；國內文獻報道TOP2A基因擴增率為12.6%～19.0%，未見有缺失報道[17－19]。本研究顯示，371例乳腺浸潤性導管癌患者TOP2A基因異常率為20.49%，其中擴增率為17.25%（64/371），與文獻報道基本相符。TOP2A基因和HER2原癌基因均定位于染色體17q11.2-22，且二者相近。有研究表明[9]，HER2與 TOP2A在乳腺癌中的表達存在一定相關性且共同影響乳腺癌發生發展。明潔等[18]研究顯示，TOP2A擴增及表達可能依賴于 HER2擴增及表達；TOP2A與HER2呈共表達[20]，HER2蛋白過表達與基因擴增存在一定的相關性。本研究結果顯示，HER2基因擴增（122例）高于 TOP2A基因擴增（64例），TOP2A與HER2基因共擴增53例，達82.81%，二者呈明顯相關，說明HER2基因表達可影響TOP2A基因表達。122例HER2基因擴增中有60例TOP2A基因無擴增或缺失，249例HER2無擴增中有10例TOP2A基因擴增，76例TOP2A基因擴增和缺失中有13例HER2基因并無擴增，這說明TOP2A與HER2基因雖具有相關性，但仍有各自獨立的因素存在。本研究中TOP2A基因擴增隨HER2蛋白表達增強而增高，TOP2A基因缺失在HER2蛋白表達為3＋時最高，說明HER2蛋白過表達不但與HER2基因擴增相關，與TOP2A基因異常也存在一定的相關性。此外我們發現，TOP2A基因改變與患者年齡、性別和部位及淋巴結轉移均無相關性，男性乳腺癌異常率雖然高于女性，但無統計學意義，可能是由于樣本例數較少，還有待于積累病例數進一步明確。浸潤性導管癌組織學分級越高，腫瘤細胞分化程度越差，TOP2A基因異常率就越高，而且腫瘤直徑為2～5 cm時TOP2A基因擴增和缺失率較高。此外，76例TOP2A基因異常的浸潤性導管癌中有16例伴有不同分化程度的原位癌，以高級別原位癌為主，這可能是腫瘤在從原位癌發展為浸潤癌的過程中細胞增殖比較活躍導致異常率增高的原因。

TOP2A是蒽環類抗生素的靶酶，TOP2A基因擴增或缺失可影響蒽環類藥物的反應及藥效[21－22]，而HER2狀態對預測蒽環類藥物的化療效果尚無定論。有研究報道[19]，TOP2A可能比HER2對蒽環類藥物更有預測作用。因此，臨床在使用蒽環類藥物治療時，應分別進行TOP2A及HER2基因檢測，尤其是對HER2蛋白高表達、腫瘤組織分級高的患者。

乳腺浸潤性導管癌TOP2A基因、HER2基因及蛋白的表達存在復雜性，但已成為乳腺癌治療和預后評估的重要指標，TOP2A基因檢測可能是乳腺浸潤性導管癌蒽環類藥物使用的重要依據。

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