肺腺癌轉移相關轉錄本1在乳腺癌患者血漿中的表達及臨床意義

楊卉，許文林，蘇兆亮，陳琦

（1.江蘇大學第四附屬醫院乳腺科，江蘇鎮江212001；2.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013）

乳腺癌是女性最為常見的一種惡性腫瘤，發病率和死亡率呈不斷上升的趨勢[1－2]，早期診斷和治療可有效降低死亡率。目前，乳腺癌的疾病篩查和對重點人群的監控主要基于血清學檢測，如CA153、CA125以及癌胚抗原，這些腫瘤標志物的診斷敏感度和特異性都較低，限制了其在臨床診療過程中對原發性乳腺癌早期診斷的應用價值[3]。國內有學者[4]研究發現，在乳腺癌篩查過程中，如果單獨使用某一個腫瘤標志物，敏感度不超過10%，而即使聯合多種標志物來篩查，敏感度最多達20%左右。因此，尋求乳腺癌血清學篩查的新型標志物成為研究的重點[5]。

近來研究發現，患者血漿miRNAs作為乳腺癌診斷標志物顯示出比傳統標志物更高的臨床應用價值[6－8]。Huang等[9]用 RNA深度測序技術檢測發現外泌體中存在一些長鏈非編碼（long chain noncoding，lnc）RNA，直接證實了外周血中存在 lncRNA。大多數學者認為乳腺癌患者血液中循環核酸是由癌細胞凋亡或壞死而釋放的[10－11]。肺腺癌轉移相關轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT-1）是長度約為8 700 nt，定位于人類染色體11q13.1的 lncRNA。MALAT-1在多種腫瘤細胞中呈高表達，如乳腺癌細胞，其高表達與細胞高增殖擴散能力相關[12－15]。近來研究發現，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平明顯高于乳腺良性疾病者[16]。但是，外周血中過表達的MALAT-1與乳腺癌基因分型的關系及其較傳統標志物CA153、CA125對乳腺癌的診斷價值尚不清楚。因此，本研究擬通過實時熒光定量PCR（qRTPCR）方法檢測MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達，分析血漿MALAT-1與各臨床病理特征的相關性以及對乳腺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 標本收集

選取2016年1月至2017年8月在鎮江市第四人民醫院及鎮江市第一人民醫院乳腺外科行乳腺癌切除術患者60例；年齡為41～82歲，中位年齡50歲。所有患者術前均未接受過手術、放療及化療。共收集到60例配對的乳腺癌組織及癌旁組織（距腫瘤＞5 cm，經病理檢查證實為正常乳腺組織且不伴雜質），離體30 min內保存于液氮罐中。選取同期在鎮江市第四人民醫院行乳腺腫塊切除術，術后病檢確診為乳腺纖維瘤的女性患者60例，年齡29～67歲，中位年齡49歲。患者均簽署知情同意書，所有試驗均獲得醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 組織 RNA提取試劑 RNAiso Plus及血漿 RNA提取試劑 RNAiso Blood，Prime-ScriptTMRTⅡ反轉錄試劑盒，SYBR?Premix ExTaqⅡ擴增試劑盒（大連寶生物TaKaRa公司）；lncRNA MALAT-1引物由廣州銳博生物科技公司合成；血漿CA153和癌胚抗原檢測試劑盒（瑞士Roche公司）。

1.2.2 主要儀器 C1000TM熒光定量PCR儀器、凝膠成像系統ChemiDoc TMXRS＋凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）；微量分光光度儀（北京美林恒通儀器有限公司）；Cobas e601化學發光免疫分析儀（瑞士Roche公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 血樣采集及處理 所有患者于術前1 d采集空腹全血5 mL，于EDTA-K2抗凝管，2 000 r/min離心20 min，取血漿，于－80℃保存。

1.3.2 組織和血漿 RNA提取及反轉錄 采用RNAiso試劑提取組織與血漿中的RNA。行純度和完整性檢測，剔除不合格標本。采用試劑盒（Prime-ScriptTMRTⅡ）行反轉錄反應，以提取的總RNA為模板，反應總體積為20μL。加入相應試劑后于PCR儀內進行cDNA合成。產物于－80℃保存。

1.3.3 qRT-PCR檢測 MALAT-1的表達 MALAT-1引物序列及退火溫度見表1，GAPDH作為內參[11－13]。應用PCR擴增儀檢測每個擴增循環后SYBR?GreenⅠ熒光信號水平。20μL反應體系，反應條件：95℃預變性10min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。運用熔解曲線檢測擴增產物純度。采用相對定量2－ΔΔCt法計算表達量。

表1 引物序列和退火溫度

1.3.4 血漿CA125和CA153含量檢測 采用Cobas e601電化學發光免疫分析儀檢測血漿中CA125及CA153含量。CA125參考范圍為0～35 U/mL，CA153參考范圍為0～30 U/mL。

1.4 統計分析

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計分析，采用 MedCalc 11.4.2.0繪制ROC曲線。非正態分布的定量資料以中位數±四分位數間距（M±QR）表示；兩組獨立樣本間比較采用Mann-WhineyU檢驗，兩組配對樣本間采用Wilcoxon符號秩和檢驗。采用Spearman秩相關系數檢驗兩個隨機變量之間的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MALAT-1在乳腺癌組織和血漿中的表達

由圖1可見，乳腺癌組織MALAT-1表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義（Z＝－6.737，P＜0.01）。乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平明顯高于纖維瘤患者，差異有統計學意義（Z＝－9.449，P＜0.01）。

2.2 血漿與乳腺癌組織中MALAT-1表達的相關性

Spearman秩相關分析顯示，乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達水平與癌組織的表達水平呈一定的正相關（rs＝0.501，P＜0.01）。見圖2。

圖1 qRT-PCR檢測組織和血漿中MALAT-1的表達

圖2 乳腺癌組織和血漿中MALAT-1表達的相關性

2.3 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達與臨床病理參數相關性

對乳腺癌患者的病理資料進行統計分析，結果顯示患者血漿MALAT-1表達水平與淋巴結轉移及基因分型相關，差異有統計學意義（P均＜0.01）；與患者年齡、TNM分期、病理類型、雌激素受體、孕激素受體、cerbB-2、p53及 Ki67無相關性（P＞0.05）。見表 2、圖3。

表2 乳腺癌患者血漿中MALAT-1表達與臨床病理參數的相關性 M±QR

續表2

圖3 MALAT-1在不同乳腺癌患者血漿中的表達

圖4 血漿中MALAT-1、CA125和CA153診斷乳腺癌的ROC曲線

2.4 血漿中MALAT-1對乳腺癌的診斷價值

由圖4可見，乳腺癌患者血漿中MALAT-1過表達曲線下面積（AUC＝0.961）明顯大于 CA125（AUC＝0.618，P＝0.022）和 CA153（AUC＝0.623，P＝0.016）。MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153；聯合應用3項指標檢測的診斷敏感度高于各指標單獨檢測。見表3。

表3 各項指標單獨檢測和聯合檢測的敏感度和特異性

3 討論

MALAT-1具有調節細胞周期的功能，可通過提高B-Myb的表達使細胞從G1期向S期、G2期向M期轉變，從而促進腫瘤細胞增殖[12，17]。研究證明[18－19]，可根據外周血細胞中 MALAT-1表達的差異區分非小細胞肺癌患者和健康者，表明其可作為非小細胞肺癌的診斷和預后指標。MALAT-1與乳腺癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移有關。Zhao等[20]發現高濃度 17β-雌二醇（E2）可使下游靶點MALAT-1表達水平下降，從而減弱MALAT-1對乳腺癌細胞增殖及侵襲轉移的影響。此外，有學者發現乳腺癌患者血漿MALAT-1水平較良性結節者明顯升高，其高表達可作為乳腺癌診斷的生物學標志物[13]。本研究結果進一步證實乳腺癌患者癌組織中MALAT-1表達較癌旁組織明顯增高，其血漿中MALAT-1水平較乳腺纖維瘤患者明顯增高。為更加明確血漿MALAT-1對乳腺癌的診斷價值，對乳腺癌患者血漿中高表達的MALAT-1及乳腺癌傳統標志物CA125和CA153繪制ROC曲線，發現MALAT-1診斷敏感度和特異性高于CA125和CA153，聯合3項指標檢測的診斷敏感度高于各指標單獨檢測。此外，乳腺癌患者血漿MALAT-1水平與組織MALAT-1水平具有一定相關性，這些均表明血漿MALAT-1可能為乳腺癌診斷的潛在標志物。

本研究結果表明，血漿MALAT-1表達水平與基底樣型乳腺癌以及淋巴結轉移相關。近幾年采用基因表達和免疫組化的方法將乳腺癌分為LuminalA、LuminalB、cerbB-2過表達型和基底樣型四大類。其中，基底樣型乳腺癌又稱三陰性乳腺癌，指雌激素受體、孕激素受體和cerbB-2表達均為陰性的乳腺癌，約占所有乳腺癌患者15%，其生物學特點表現為侵襲性強，易出現淋巴結轉移，因缺乏內分泌及抗cerbB-2治療的靶點，此類乳腺癌患者預后較差[21－23]。后續我們將進一步研究MALAT-1對三陰性乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

綜上所述，血漿MALAT-1有望成為乳腺癌診斷的潛在分子標志物。后續將隨訪60例乳腺癌患者的預后來探索MALAT-1在乳腺癌中的臨床實用價值。

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