小RNA SbfR增強(qiáng)傷寒沙門(mén)菌動(dòng)力和侵襲力

孫嘉遙，陸仁飛，趙昕，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門(mén)菌（Salmonella entericaserovar Typhi，S.Typhi）是沙門(mén)菌屬中一種人類(lèi)腸道致病菌，通常通過(guò)污染的食物由消化道進(jìn)入人體。S.Typhi可侵襲進(jìn)入小腸黏膜，并克服人體免疫吞噬細(xì)胞的殺傷作用，再經(jīng)血液進(jìn)入肝脾等全身組織，造成嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染——傷寒熱[1－2]。

細(xì)菌中存在大量的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），它們活躍參與細(xì)菌各個(gè)方面的基因表達(dá)調(diào)控[3－4]。根據(jù)作用方式可將ncRNA分為順式編碼RNA和反式作用RNA。其中，反式作用RNA大多＜200 nt，又稱(chēng)為小RNA（sRNA）。sRNA往往在遠(yuǎn)處有多個(gè)靶基因，且常在伴侶分子Hfq的協(xié)助下與靶mRNA形成不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)揮作用[5－6]。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了S.Typhi轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的長(zhǎng)為138 nt的 sRNA，命名為SbfR（原名稱(chēng)為T(mén)64）[7]，其基因序列位于yegD與一假定蛋白St00898基因之間。目前已對(duì)該sRNA進(jìn)行了表達(dá)特性分析和相關(guān)菌株構(gòu)建[8]，但對(duì)其在S.Typhi中發(fā)揮的作用尚未深入研究。

本研究對(duì)已構(gòu)建的SbfR相關(guān)菌株進(jìn)行表型和基因芯片分析，以查找表達(dá)差異基因，為后續(xù)尋找SbfR的靶基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 H：z66陽(yáng)性S.Typhi野生株GIFU 10007（WT）為日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈(zèng)。質(zhì)粒pBAD/Myc-HisA為 Promega公司產(chǎn)品。S.Typhi空載體株（WT＋pBAD/Myc-HisA）、S.Typhi SbfR缺陷株（△SbfR＋pBAD/Myc-HisA）、S.Typhi SbfR回補(bǔ)株（△SbfR＋pBAD/Myc-HisA-SbfR）由本實(shí)驗(yàn)室制備及保存[8]。HeLa細(xì)胞購(gòu)自上海生科院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要材料與試劑 胰蛋白胨、酵母提取物、氨芐西林、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Oxoid公司）；NaCl、NaOH、鹽酸、無(wú)水乙醇、異丙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；L-阿拉伯糖、SYBR熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶Ⅰ快速DNA消化試劑盒（TaKaRa公司）；基因特異性引物合成（蘇州泓訊生物科技有限公司）；熒光染料 Cy3-dCTP、Cy5-dCTP（Amersham公司）；總RNA提取試劑盒（Qiagen公司）；檢測(cè)S.Typhi基因組的基因芯片（本實(shí)驗(yàn)室制備保存）。

1.1.3 主要儀器 PCR儀（美國(guó) ABI公司，型號(hào)2720）；NanoDrop ND-1000核酸紫外檢測(cè)儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，型號(hào)HERAEUSMegafuge）；核酸雜交儀（英國(guó)Roller-Blot公司，型號(hào) hybridiser HB-3D）；基因芯片掃描分析系統(tǒng)（美國(guó) Axon Instruments公司，型號(hào)Genepix personal 4100A）。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將S.Typhi空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株的單菌落分別接種于2 mL LB培養(yǎng)基（含0.1 mg/mL氨芐西林），37℃、250 r/min振蕩過(guò)夜。第2天，1∶100轉(zhuǎn)接后以相同條件培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[D（600 nm）≈0.4]，加入 0.2%（W/V）L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)30 min誘導(dǎo)SbfR表達(dá)。

1.3 細(xì)菌動(dòng)力實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)的空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株菌液各0.5μL，點(diǎn)種于含0.3%瓊脂的LB半固體平板，37℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜，檢測(cè)動(dòng)力圈直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前1 d將24×105個(gè)細(xì)胞按密度為1×105個(gè)/mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。按照MOI為20∶1的比例向每孔細(xì)胞中加入培養(yǎng)的空載體株、SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株菌液，繼續(xù)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min；棄上清液，用PBS將每孔輕緩吹洗3次。一半孔內(nèi)加入1 mL 0.5%（V/V）TritonX-100裂解細(xì)胞，孵育10 min后涂于LB平板，培養(yǎng)過(guò)夜后其克隆數(shù)代表黏附水平（以T0表示）；余下一半孔內(nèi)加入100 mg/L慶大霉素殺死胞外菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后同樣以1 mL 0.5%（V/V）TritonX-100裂解細(xì)胞，過(guò)夜培養(yǎng)后計(jì)算單克隆數(shù)代表侵襲水平（以T90表示）。重復(fù)3次后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 基因芯片檢測(cè)S.Typhi全基因組表達(dá)水平

為進(jìn)一步研究sRNA SbfR增強(qiáng)S.Typhi動(dòng)力和侵襲力的機(jī)制，利用本實(shí)驗(yàn)室前期制備的基因芯片篩查SbfR缺陷株和SbfR回補(bǔ)株基因表達(dá)譜差異，Log2R的絕對(duì)值＞1為判斷差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。采用4 000 r/min離心收集SbfR缺陷株和回補(bǔ)株。使用總RNA提取試劑盒提取總RNA，加入Cy3-dCTP、Cy5-dCTP進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，cDNA產(chǎn)物與基因芯片于核酸雜交儀中雜交18 h，次日下午洗片、掃描，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[9]。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)有表達(dá)差異的4種基因的mRNA表達(dá)

挑選基因芯片中4種表達(dá)差異的基因fliA、fljB、sopE和prgJ進(jìn)行qRT-PCR分析。將培養(yǎng)的SbfR缺陷株和回補(bǔ)株以4 000 r/min離心收集細(xì)菌。Trizol法提取細(xì)菌總RNA。取1μg總RNA，以下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用兩步法qRT-PCR（95℃ 150 s預(yù)變性，95℃ 10 s，65℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)），其中5s為內(nèi)參基因，觀察相關(guān)基因在各菌株中的轉(zhuǎn)錄水平。所用qRT-PCR引物：5s上游 5′-TTGTCTGGCGGCAGTAGC-3′，下 游 5′-TTTGATGCCTGGCAGTTC-3′；fliA上游 5′-GCGATGCTGGATGAATTACG-3′，下游 5′-TCGGTTTCCGTCGCATTAC-3′；fljB上游 5′-CAACCGCTAGTGATTTAGTTT-3′，下 游 5′-CTGTCCCTGTAGTAGCCGTAC-3′；sopE上游 5′-GCAACACACTTTCACCGAGG-3′，下 游 5′-CGGGGTCTTTACTCGCACTA-3′；prgJ上游 5′-GACATTGTCTCGCTGGATGA-3′，下游 5′-TCTTGCGAAATAGCCAGCTC-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 sRNA SbfR對(duì) S.Typhi動(dòng)力的影響

細(xì)菌動(dòng)力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體株相比，SbfR缺陷株的動(dòng)力圈明顯減小（t＝17.44，P＜0.01），而回補(bǔ)株與對(duì)照株的動(dòng)力圈大小基本一致。此結(jié)果表明sRNA SbfR可增強(qiáng)S.Typhi的動(dòng)力。

圖1 3種菌株動(dòng)力圈比較

2.2 sRNA SbfR對(duì) S.Typhi侵襲力的影響

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體株比較，缺陷株對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力顯著下降（t＝30.18，P＜0.01），而回補(bǔ)株與對(duì)照株侵襲力基本一致，說(shuō)明sRNA SbfR可以促進(jìn)S.Typhi對(duì)上皮細(xì)胞的侵襲。

圖2 3種菌株對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲力

2.3 基因芯片分析sRNA SbfR對(duì)S.Typhi轉(zhuǎn)錄組的影響

基因芯片篩查結(jié)果顯示，缺陷株與回補(bǔ)株的表達(dá)差異基因共有85個(gè)，主要為鞭毛、熱休克、酶等相關(guān)基因。其中與鞭毛相關(guān)基因10種，侵襲相關(guān)基因2種。具體下調(diào)的基因功能及表達(dá)差異見(jiàn)表1。

表1 SbfR缺陷株中下調(diào)的12種基因

2.4 4種差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

qRT-PCR結(jié)果顯示，回補(bǔ)SbfR后fliA、fljB、sopE基因表達(dá)均上調(diào)（P均＜0.05），而prgJ表達(dá)水平不變（圖3）。qRT-PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致，表明SbfR可以促進(jìn)S.Typhi鞭毛和侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖3 qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片結(jié)果

3 討論

sRNA在S.Typhi基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。sRNA主要通過(guò)與靶mRNA形成不完全堿基互補(bǔ)配對(duì)發(fā)揮作用，其與靶基因的作用方式主要有兩種：①與靶mRNA局部結(jié)合形成雙鏈，干擾RNA酶E的降解作用，影響靶mRNA的穩(wěn)定性；②與靶mRNA的5′端結(jié)合，影響靶mRNA SD序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響靶基因的翻譯效率[10]。

鞭毛是細(xì)菌重要的動(dòng)力結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。大約50個(gè)基因與鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)關(guān)系可將這些基因分為三級(jí)。其中，flhDC為一級(jí)基因，調(diào)節(jié)下游所有二、三級(jí)鞭毛基因；fliA為二級(jí)基因，調(diào)節(jié)如fljB、fliC等三級(jí)鞭毛基因[11]。本研究中基因芯片和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示，SbfR通過(guò)上調(diào)二、三級(jí)鞭毛基因fliA、fljB等的表達(dá)，增強(qiáng)S.Typhi的運(yùn)動(dòng)能力。

S.Typhi穿過(guò)上皮層的過(guò)程中，首先黏附于腸上皮細(xì)胞表面，隨后侵襲進(jìn)入靶細(xì)胞。這一過(guò)程需要多種侵襲、菌毛、鞭毛基因以及調(diào)節(jié)因子等參與[12]。sopE和prgJ分別編碼胍基交換因子和Ⅲ型分泌系統(tǒng)內(nèi)部棒狀蛋白，均可增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的侵襲力[13－14]。本研究中sopE的 qRT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致，而prgJ則存在矛盾，推測(cè)可能是由于實(shí)驗(yàn)方法和閾值差異引起?；蛐酒蛁RT-PCR結(jié)果表明，sopE表達(dá)水平下調(diào)與鞭毛相關(guān)基因水平下降引起的動(dòng)力減弱可能共同降低了S.Typhi對(duì)HeLa細(xì)胞的侵襲能力。

綜上，本研究通過(guò)S.Typhi動(dòng)力和細(xì)胞侵襲表型實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)sRNA SbfR可增強(qiáng)S.Typhi的動(dòng)力和侵襲力；并分析了基因芯片和qRT-PCR結(jié)果，發(fā)現(xiàn)sRNA SbfR可促進(jìn)S.Typhi鞭毛相關(guān)基因（fliA、fljB）和侵襲相關(guān)基因（sopE）的轉(zhuǎn)錄。然而，研究結(jié)果雖表明SbfR對(duì)鞭毛和侵襲相關(guān)基因存在調(diào)控作用，但并未確定它們是否為SbfR的靶基因。因此SbfR靶基因的確定及其與靶基因的結(jié)合位點(diǎn)仍需進(jìn)一步的研究確定。

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