rL-RVG通過拮抗α7煙堿型乙酰膽堿受體影響胃癌細胞凋亡及增殖

尹超云，嚴玉蘭，章安偉，張烜烽，步雪峰

（1.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2.江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇鎮江212002；3.江蘇大學附屬人民醫院呼吸內科，江蘇 鎮江212002）

乙酰膽堿受體在很多腫瘤細胞中高度表達，如非小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、大腸癌等[1]。研究發現α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7-nAChR）的表達與激活對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移[2]，血管生成[3]和炎癥反應[4]具有重要影響。尼古丁等藥物可通過激活乙酰膽堿受體促進胃癌細胞增殖及轉移[5]；5-氟尿嘧啶可抑制α7-nAChR表達，發揮抗腫瘤作用[6]。新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是一種以感染禽類為特點的雞瘟病毒[7]，屬于禽副黏病毒科的副黏病毒Ⅰ型[8]。有研究發現NDV病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、狂犬病毒等多種病毒具有溶瘤作用[9－10]。煙堿型乙酰膽堿受體可與狂犬病毒糖蛋白（rabies virus glycoprotein，RVG）結合[11]，且 RVG的 G蛋白具有與銀環蛇毒相近的煙堿型乙酰膽堿受體阻斷作用[12]。重組 LaSota株新城疫病毒（recombinant La-Sota strain NDV expressing the rabies virus glycoprotein，rL-RVG）可以穩定表達 RVG[13]，關于 rL-RVG是否可以通過拮抗乙酰膽堿途徑影響胃癌HGC細胞凋亡及增殖尚不清楚。本實驗采用rL-RVG感染HGC細胞，旨在探索細胞凋亡及增殖與乙酰膽堿途徑之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI 1640培養基（Gibco公司），胎牛血清（HyClone公司）。人胃癌HGC細胞由中國科學院上海生科院細胞資源中心提供，NDV病毒株及rLRVG病毒株由哈爾濱獸醫研究所饋贈。Tris緩沖液（0.05 mol/L TBS，pH＝7.35，自制）；羊抗兔 α7-nAChR抗體（南京厚載公司）；羊抗兔pro-caspase 3抗體（ImmunoWay公司）。核熒光染料（Hoechst 33342），Triton X-100、MTT試劑盒（Sigma公司）。HRP標記羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG（上海康為世紀公司）。α7-nAChR抑制劑甲基牛扁亭堿為Santa Cruz公司產品，α7-nAChR激動劑溴化乙酰膽堿（Sigma公司）；Alexa Flour 488標記羊抗鼠IgG、Cy3標記羊抗鼠IgG（美國KLP公司），DFC300 FX熒光顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.2 細胞培養和病毒感染

將NDV、rL-RVG病毒原液用未加血清的1640培養基稀釋1 000倍。用含10%滅活胎牛血清的1640培養基在37℃及5%CO2的飽和濕度下培養HGC細胞，每隔24 h更換含10%胎牛血清的培養基，當細胞在培養瓶中覆蓋率達80%時進行傳代培養。傳3代后將細胞接種于6孔板中，待細胞達到50%～70%融合時，將其隨機分為rL-RVG組、NDV組及PBS組，分別加入上述稀釋的rL-RVG、NDV病毒液及PBS 2 mL，培養1 h，再更換含10%胎牛血清的培養基繼續培養24 h。

1.3 MTT檢測rL-RVG對HGC細胞增殖的影響

用無血清1640培養基分別將rL-RVG及NDV病毒原液稀釋至以下濃度：10－1、10－2、10－3、10－4、10－5mmol/L。將HGC細胞接種于96孔板（5×104/mL），每孔100μL，培養過夜，次日換含20 mL/L胎牛血清的1640培養基，在rL-RVG組和NDV組分別加入病毒液，PBS組加入PBS；每組設5個平行孔，1640完全培養基為調零孔。培養24 h，每孔加入20 μLMTT，培養4 h，每孔加入150μL二甲基亞砜溶解，酶標儀490 nm測定光密度（D）值，實驗重復3次，計算細胞活力值＝（實驗組平均D值/對照組平均D值）×100%。

1.4 免疫熒光染色觀察HGC細胞中α7-nAChR的表達

取rL-RVG、NDV、PBS 3組細胞，分別使用4%低聚甲醛在室溫下固定20 min，PBS洗3次，PBS稀釋的0.5%Triton X100室溫下處理細胞30 min，PBS洗3遍，5%的BSA封閉1 h，加入PBS溶解的α7-nAChR抗體（1∶100），4℃孵育過夜。洗3次，5 min/次；Cy3標記的兔二抗（1∶200）染色1 h，PBS洗3次，5 min/次；Hoechst 33342染色細胞核 10 min，PBS洗3次后再置于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 rL-RVG感染后的細胞形態學變化

將HGC細胞接種至6孔板培養，分為rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組、NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組，rL-RVG組、NDV組、PBS組，rL-RVG＋α7-nAChR激動劑組、NDV＋α7-nAChR激動劑組、PBS＋α7-nAChR激動劑組。當細胞生長至50%～70%密度時，各抑制劑組加入10－3mmol/L的甲基牛扁亭堿預處理4 h，各激動劑組加入10－3mmol/L的溴化乙酰膽堿預處理4 h；棄培養基，PBS洗 2遍；然后 rL-RVG組、rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組、rL-RVG＋α7-nAChR激動劑組感染rL-RVG；NDV組、NDV＋α7-nAChR抑制劑組、NDV＋α7-nAChR激動劑組感染NDV，PBS組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR激動劑組直接用PBS處理。倒置顯微鏡下觀察受病毒感染的細胞形態。

1.6 蛋白質印跡法檢測 RVG、NDV、pro-caspase 3、bax、bcl-2、α7-nAChR蛋白的相對表達

將方法“1.2”及“1.5”中經過處理的 HGC細胞種植于6孔板上（5×104個/mL），培養24 h后提取細胞蛋白，后經SDS-PAGE轉膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入小鼠抗RVG抗體（1∶300）、雞抗NDV抗體（1∶300）、羊抗兔 pro-caspase 3抗體（1∶1 000）、羊抗兔 α7-nAChR抗體（1∶500）、羊抗兔 bax抗體（1∶400）、羊抗兔 bcl-2抗體（1∶400）、羊抗鼠β-肌動蛋白抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜；TBST洗3次，加羊抗鼠或羊抗兔 HRP標記 IgG（1∶3 000）室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，ECL發光劑發光顯色，在Typhoon 9400掃描儀上掃描記錄，用LANE.1D軟件（北京賽制公司）進行條帶灰度值結果分析。

1.7 統計學處理

應用GraphPad Prism 6軟件進行數據處理，數據以均數±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rL-RVG對 HGC細胞RVG、NDV、pro-caspase 3與α7-nAChR蛋白表達的影響

蛋白質印跡結果顯示，與PBS組及NDV組比較，RVG蛋白在rL-RVG組中顯著性表達（P均＜0.01）；與 PBS組比較，NDV、pro-caspase 3和 α7-nAChR蛋白在rL-RVG組及NDV組中的表達均明顯升高（P均＜0.01）；rL-RVG組與NDV組NDV蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；rL-RVG組α7-nAChR、pro-caspase3蛋白表達明顯高于NDV組（P均＜0.01）。見圖1。

2.2 rL-RVG對HGC細胞增殖的影響

MTT檢測結果顯示，不同濃度NDV和rL-RVG作用HGC細胞24 h后，細胞活力值隨濃度增加而降低。與PBS對照組相比，各稀釋濃度rL-RVG及NDV對細胞的增殖均有明顯抑制作用（P＜0.05）。見圖2。

圖1 HGC細胞感染rL-RVG后RVG、NDV、pro-caspase 3和α7-nAChR蛋白的表達

圖2 不同濃度NDV、rL-RVG病毒對胃癌HGC細胞增殖的影響

2.3 rL-RVG感染后HGC細胞α7-nAChR蛋白的熒光表達

免疫熒光染色結果顯示，rL-RVG組HGC細胞α7-nAChR的表達明顯高于NDV組及PBS組，NDV組高于PBS組（圖3）。

2.4 rL-RVG感染后細胞形態學的變化

各組細胞經相應處理24 h后倒置顯微鏡下可見，細胞逐漸由貼壁生長狀態轉為懸浮生長狀態，細胞膜皺縮，凋亡增多。rL-RVG組較NDV明顯；α7-nAChR抑制劑處理過的 NDV組、PBS組分別較NDV組、PBS組明顯，但rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組差別不大；經α7-nAChR激動劑處理過的rL-RVG組、NDV組和PBS組分別較rL-RVG組、NDV組和PBS組細胞膜明顯皺縮，凋亡狀態明顯減弱。見圖4。

圖3 rL-RVG感染后HGC細胞α7-nAChR蛋白表達（熒光顯微鏡×1 000）

2.5 rL-RVG感染后 HGC細胞 pro-caspase 3、bax、bcl-2的相對表達量

蛋白質印跡結果顯示，rL-RVG組和NDV組pro-caspase 3、bax表達明顯高于 PBS組（P均＜0.01）。

pro-caspase3、bax蛋白在 NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組分別較NDV組、PBS組明顯提高（P均＜0.01），在 rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組間無明顯差異（P＞0.05）；bcl-2蛋白在NDV＋α7-nAChR抑制劑組、PBS＋α7-nAChR抑制劑組表達量分別明顯低于NDV組、PBS組（P均＜0.01），在rL-RVG＋α7-nAChR抑制劑組與rL-RVG組間無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 rL-RVG感染后HGC細胞的形態學變化（倒置顯微鏡×1 000）

pro-caspase3、bax蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激動劑組表達顯著低于rL-RVG組（P＜0.05或P＜0.01），而NDV＋α7-nAChR激動劑組的表達量明顯低于NDV組（P均＜0.01）。bcl-2蛋白在 rL-RVG＋α7-nAChR激動劑組表達顯著低于rL-RVG組（P＜0.05），而 NDV＋α7-nAChR激動劑組的表達量明顯高于NDV組（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

胃癌細胞中廣泛表達α7-nAChR，α7-nAChR參與腫瘤的侵襲、增殖和轉移[4]。rL-RVG穩定表達的RVG可與煙堿型乙酰膽堿受體結合，對其具有阻斷作用[11－13]，所以我們猜測rL-RVG可以通過拮抗α7-nAChR受體促進胃癌細胞凋亡及抑制胃癌細胞增殖。

本研究MTT試驗顯示，當病毒濃度接近于10－5mmol/L時，rL-RVG、NDV組的細胞活力明顯受到抑制。同時免疫熒光及蛋白質印跡證實胃癌細胞穩定表達α7-nAChR，加入rL-RVG病毒后α7-nAChR蛋白表達明顯提高。α7-nAChR表達升高應該會抑制腫瘤細胞凋亡[6]，但凋亡蛋白及光鏡下形態學結果顯示rL-RVG作用后HGC細胞凋亡增多。rL-RVG感染HGC細胞產生的RVG的G蛋白競爭性抑制了α7-nAChR，進一步促進HGC細胞凋亡，從α7-nAChR免疫熒光及蛋白質印跡可以看出，RVG的G蛋白對α7-nAChR有拮抗作用，引起α7-nAChR反饋性上調。而且蛋白質印跡結果顯示，α7-nAChR抑制劑作用HGC細胞24 h后，pro-caspase 3及bax表達量與rL-RVG組無明顯差異，說明rL-RVG本身產生的RVG產生同樣的效果。但NDV及PBS組加入抑制劑后其表達量增多，證明了α7-nAChR抑制劑可以促進胃癌細胞凋亡，這與本課題組的前期實驗相符[10]。

同時，α7-nAChR激動劑加入rL-RVG組和NDV組后pro-caspase 3及bax蛋白表達受到明顯抑制，進一步證實rL-RVG感染HGC通過拮抗α7-nAChR途徑促進胃癌細胞的凋亡和抑制其增殖。

本實驗是對rL-RVG殺腫瘤作用理論的補充，為rL-RVG在臨床上治療腫瘤晚期患者提供了一定實驗基礎。關于rL-RVG通過煙堿型乙酰膽堿受體作用哪些途徑導致HGC細胞凋亡還需進一步探索。

圖5 rL-RVG感染后HGC細胞凋亡相關蛋白的表達

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