皮膚橋蛋白在肥胖小鼠脂肪中的表達

白寧寧，嚴寒，琚麗萍，陳淑芹，張菁，胡瑞瑋，楊穎，方啟晨

（上海交通大學附屬第六人民醫院糖尿病研究所，上海200233）

脂肪組織的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是存在于細胞之間的致密動態網絡結構，主要由血管基質細胞（stromal vascular fraction，SVF）和脂肪細胞合成和分泌，不僅為脂肪組織提供結構支撐，還可通過各種細胞外信號途徑，在生理和病理條件下調節脂肪組織重構[1]。ECM由多種成分組成，其中很大比例是各種類型的膠原蛋白，比如Ⅰ－Ⅳ型膠原蛋白[2]。此外，還存在許多非膠原蛋白，動態調節組織結構與功能。

皮膚橋蛋白（dermatopontin，DPT）是一種相對分子質量為22 kD的分泌性蛋白，最初在提純牛皮膚核心蛋白多糖的實驗中被發現[3]。DPT在ECM非膠原蛋白中所占比例非常高，在哺乳動物皮膚、骨骼肌、心臟、肺、肝等組織和器官中廣泛表達[4]，其部分酪氨酸殘基可被硫酸化，硫酸化的酪氨酸可以調節ECM蛋白間的相互作用[5]。我們在實驗中發現DPT在人和小鼠脂肪中的基礎表達很高，但目前尚不明確DPT作為一種非膠原蛋白在脂肪組織中的作用。另外，抗糖尿病藥物過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ）激動劑可通過抑制脂肪細胞和巨噬細胞中膠原蛋白的轉錄，從而發揮潛在的抗纖維化作用[6]，但它對非膠原蛋白DPT基因表達的影響報道甚少。本研究擬在飲食誘導肥胖小鼠模型上觀察DPT在脂肪組織中的表達變化，以及PPARγ激動劑羅格列酮干預后3T3-L1分化成熟的脂肪細胞DPT基因的變化趨勢，為進一步探討DPT在肥胖等代謝性疾病中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料

35只6周齡雄性C57BL/6J小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），普通飼料和高脂飼料（Diet Research公司），3T3-L1細胞株（ATCC細胞庫），DMEM培養基、胎牛血清（Gibco公司），羅格列酮、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、膠原酶（Sigma公司），胰島素（常規優泌林），Trizol試劑（Invitrogen公司），RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF和BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天公司），引物（上海生物工程有限公司），逆轉錄和SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司），鼠源性DPT單克隆抗體（Santa公司），兔源性HSP90多克隆抗體作為內參抗體（Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 飲食誘導肥胖小鼠模型的建立 6周齡C57BL/6J雄性小鼠適應性喂養2周后，隨機分為正常飲食組和高脂飲食組，分別給予普通飼料 （10%熱卡來自脂肪）和高脂飼料（60%熱卡來自脂肪）喂養16周，每組各10只。以上實驗經過上海交通大學附屬第六人民醫院動物福利與倫理委員會的批準。

1.2.2 脂肪組織SVF和脂肪細胞的分離 15只6周齡小鼠分為3組，每組5只。小鼠過量麻醉處死后，取出皮下和內臟脂肪，緩沖液反復沖洗后剪碎，膠原酶 37℃消化 60 min，2 000 r/min離心 10 min。去上清液，紅細胞裂解液處理10 min，離心去上清液；緩沖液沖洗離心，靜置10 min，上層為脂肪細胞，下層為SVF。

1.2.3 3T3-L1細胞的誘導分化及藥物處理 將3T3-L1細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，待細胞融合后，加入誘導液A（10%胎牛血清的 DMEM含 0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松、1.7μmol/L胰島素），隔天更換誘導液B（10%胎牛血清的DMEM含1.7μmol/L胰島素），繼續培養直至出現大量脂滴。濃度梯度實驗：以不同劑量（0、0.25、0.5、1、2μmol/L）羅格列酮處理脂肪細胞24 h；時間梯度實驗：以2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 0、4、12、24、48 h。

1.2.4 實時定量PCR測定DPTmRNA表達 小鼠組織和細胞采用Trizol試劑抽提RNA，經逆轉錄成為cDNA，并由qPCR試劑盒進行擴增。引物序列如下，DPT：正義 5′-CTGCCGCTATAGCAAGAGGT-3′，反義 5′-TGGCTTGGGTACTCTGTTGTC-3′；36B4：正義 5′-AAGCGCGTCCTGGCATTGTCT-3′，反 義 5′-CCGCAGGGGCAGCAGTGGT-3′。以 36B4作為內參，計算DPTmRNA的相對拷貝數2－△△Ct。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測DPT蛋白的表達 小鼠組織和細胞總蛋白采用RIPA裂解液提取，經BCA蛋白定量試劑盒測總蛋白濃度，最后加熱變性。取20～60μg蛋白樣本聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉蛋白至硝酸纖維素膜，孵育一抗4℃過夜。次日TBST洗3次，每次5 min，過氧化物酶標記的抗兔（鼠）二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗3次，每次5 min。最后經ImageQuant凝膠圖像分析儀曝光成像。

1.2.6 GEO數據庫芯片分析 登錄NCBI數據庫Gene Expression Omnibus（GEO）Profiles窗口 （http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“DPT，adipose tissue”為檢索詞，獲得芯片及探針數據GDS3142/1418511＿at。GDS3142代表小鼠各組織基因表達芯片這一數據集，而1218511＿at代表DPT這一基因的探針，數據涉及22個器官或組織。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 DPT在人和小鼠的脂肪組織中高度表達

圖1 DPT在人類主要組織的表達譜

首先利用人類蛋白質門戶（The Human Protein Atlas）數據庫和2015年發表在《Science》上的一項人類蛋白質圖譜研究[7]，發現DPT基因在人類大多數組織中均有表達，其中mRNA表達水平在脂肪中表達最高（圖1）。同時利用 GEO數據庫（GDS3142/1418511＿at）發現，DPT mRNA在小鼠各組織的表達與人類類似，同樣在脂肪中表達最高（圖2）。提取6周齡小鼠主要組織（包括皮下、內臟、棕色脂肪，腓腸肌和比目魚肌）的RNA和蛋白，對DPT在各組織的表達進行驗證。實時定量PCR和蛋白質印跡結果顯示，DPTmRNA和蛋白表達水平均在白色脂肪中最高，其次是棕色脂肪，但在腓腸肌和比目魚肌中的表達較低（圖3）。

圖2 DPT在小鼠主要組織的表達譜

圖3 DPT mRA和蛋白在小鼠主要組織的表達

2.2 高脂飲食明顯增加白色脂肪中DPT表達水平

提取正常飲食組和高脂飲食組小鼠皮下、內臟、棕色脂肪和腓腸肌、比目魚肌的RNA和蛋白。實時定量PCR結果表明，與正常飲食組相比，高脂飲食組小鼠的皮下、內臟、棕色脂肪中DPTmRNA表達水平均明顯增加，其中在皮下脂肪中升高約6倍（t＝－8.264，P＜0.01），在內臟脂肪中升高約 2倍（t＝－4.964，P＜0.01），在棕色脂肪中升高 1.5倍左右（t＝－2.789，P＜0.01）。但腓腸肌和比目魚肌中DPTmRNA表達水平兩組間差異無統計學意義（圖4A）。蛋白質印跡結果表明，與正常飲食組相比，DPT蛋白表達水平在高脂飲食組小鼠白色脂肪中增加，其中皮下脂肪增加較為明顯（圖4B）。

圖4 DPT在正常和肥胖小鼠主要組織中的表達

2.3 DPT主要由脂肪細胞合成并分泌至胞外

進一步分離6周齡小鼠皮下和內臟脂肪組織的SVF和脂肪細胞，發現脂肪細胞的DPTmRNA和蛋白表達水平明顯高于在SVF中的表達（圖5）。

圖5 6周齡小鼠皮下和內臟脂肪組織SVF和脂肪細胞中DPT mRNA和蛋白表達差異

同時，在3T3-L1前脂肪細胞誘導分化為脂肪細胞的過程中，DPTmRNA表達水平從分化第4天起逐漸增加，并在第8天達到最高；同樣在其分化過程的細胞裂解物和上清液中，DPT蛋白表達水平也逐漸增加，并于第8天達到最高（圖6）。

圖6 DPT在3T3-L1細胞分化過程中的表達

2.4 羅格列酮下調3T3-L1脂肪細胞中DPT表達水平

實時定量PCR結果顯示，與對照組相比，以0.25、0.5、1、2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 24 h后，DPTmRNA表達水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；以 2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞 4、12、24、48 h，DPTmRNA表達水平在4 h、12 h無明顯變化，但隨著處理時間的延長，在24 h、48 h降低明顯（P＜0.05或P＜0.01）。以2μmol/L羅格列酮處理脂肪細胞48 h、72 h，DPT蛋白表達水平均明顯降低（圖7）。

3 討論

脂肪組織快速擴張的能力主要依賴于組織內各種細胞的協同反應，共同參與重構過程中的ECM重構、急性炎癥反應及適度的血管新生，其中ECM重構發揮關鍵作用[8]。而肥胖狀態下，脂肪組織發生纖維化、慢性炎癥反應及血管新生受損等病理性改變，是肥胖癥及糖尿病等系統性代謝紊亂的主要致病因素[9]。既往研究顯示，高脂飲食誘導的肥胖小鼠的脂肪組織中存在包括Ⅳ型膠原在內的膠原沉積[6]。而膠原蛋白沉積使脂肪組織可塑性減弱，并且促進肥胖機體代謝紊亂，許多其他非膠原ECM成分在肥胖機體脂肪組織也處于失調狀態[10－11]。

DPT作為一種非膠原ECM蛋白，可以與核心糖蛋白、TGF-β、Ⅰ型膠原蛋白等作用，并具有促進膠原纖維形成等功能，在多種與ECM有關的生理和病理過程中發揮作用[12－13]。最近的一項研究發現，在超重/肥胖合并非乙醇性肝炎和肝臟纖維化患者的肝臟中DPT的表達增加，而通過代謝手術治療肥胖的同時，患者肝纖維化明顯緩解，且肝臟中DPT的表達降低[14]；通過 DPT－/－小鼠模型觀察到 DPT對膠原蛋白沉積和纖維化有促進作用，而過氧化物酶體增殖物激活受體-α激活后可有效降低DPT的表達。這項研究充分說明DPT與組織纖維化之間的密切聯系，DPT可能成為逆轉組織纖維化進程的一個有效作用靶點。另外一項研究發現DPT可以調節內皮細胞TGF-β1和整合素α3β1的表達，從而促進血管新生過程[15]。

圖7 羅格列酮對3T3-L1脂肪細胞DPT基因表達的調控

本研究發現細胞外基質成員DPT在人和小鼠脂肪中表達很高，小鼠高脂飲食后DPT在脂肪中的表達明顯增加，特別是白色脂肪。我們進一步發現DPT主要由脂肪細胞合成并分泌。這提示脂肪組織作為一個活躍的內分泌器官，應對營養變化時，脂肪細胞本身可以分泌多種因子從而調節機體代謝。高脂飲食后脂肪細胞分泌增加的DPT廣泛分布于細胞外，從而影響肥胖發生發展進程中伴隨的脂肪組織結構及功能。但是DPT具體通過何種機制影響脂肪組織的結構和功能，以及DPT的表達水平是否與肥胖機體脂肪組織纖維化相關，尚需進一步明確。另外本研究發現，羅格列酮處理3T3-L1脂肪細胞后，DPT的表達量明顯降低。這說明PPARγ激動劑作為一種抗糖尿病藥物，不僅可以有效降低脂肪細胞中膠原蛋白的轉錄，從而抵抗纖維化的發生，同時可調控非膠原蛋白DPT的表達。如果DPT是肥胖發展過程中脂肪組織纖維化的風險因子之一，那么通過藥物干預DPT的表達，有可能改善肥胖相關的脂肪組織結構及功能紊亂。

[1]Sun K，Kusminski CM，Scherer PE.Adipose tissue remodeling and obesity[J].J Clin Invest，2011，121（6）：2094－2101.

[2]Ricard-Blum S，Ruggiero F.The collagen superfamily：from the extracellular matrix to the cellmembrane[J].Pathol Biol（Paris），2005，53（7）：430－442.

[3]Neame PJ，Choi HU，Rosenberg LC.The isolation and primary structure of a 22-kDa extracellularmatrix protein from bovine skin[J].J Biol Chem，1989，264（10）：5474－5479.

[4]Okamoto O，Fujiwara S.Dermatopontin，a novel player in the biology of the extracellular matrix[J].Connect Tissue Res，2006，47（4）：177－189.

[5]Yamatoji M，Kasamatsu A，Kouzu Y，et al.Dermatopontin：a potential predictor formetastasis of human oral cancer[J].Int J Cancer，2012，130（12）：2903－2911.

[6]Khan T，Muise ES，Iyengar P，et al.Metabolic dysregulation and adipose tissue fibrosis：role of collagen VI[J].Mol Cell Biol，2009，29（6）：1575－1591.

[7]Uhlen M，Fagerberg L，Hallstrom BM，et al.Proteomics.Tissue-based map of the human proteome[J].Science，2015，347（6220）：1260419.

[8]Mariman EC，Wang P.Adipocyte extracellular matrix composition，dynamics and role in obesity[J].CellMol Life Sci，2010，67（8）：1277－1292.

[9]Crewe C，An YA，Scherer PE.The ominous triad of adipose tissue dysfunction：inflammation，fibrosis，and impaired angiogenesis[J].JClin Invest，2017，127（1）：74－82.

[10]Lin D，Chun TH，Kang L.Adipose extracellular matrix remodelling in obesity and insulin resistance[J].Biochem Pharmacol，2016，119：8－16.

[11]Spencer M，Unal R，Zhu B，etal.Adipose tissue extracellularmatrix and vascular abnormalities in obesity and insulin resistance[J].JClin Endocrinol Metab，2011，96（12）：E1990－1998.

[12]MacBeath JR，Shackleton DR，Hulmes DJ.Tyrosine-rich acidic matrix protein（TRAMP）accelerates collagen fibril formation in vitro[J].J Biol Chem，1993，268（26）：19826－19832.

[13]Kato A，Okamoto O，Ishikawa K，et al.Dermatopontin interacts with fibronectin，promotes fibronectin fibril formation，and enhances cell adhesion[J].J Biol Chem，2011，286（17）：14861－14869.

[14]Lefebvre P，Lalloyer F，Bauge E，et al.Interspecies NASH disease activity whole-genome profiling identifies a fibrogenic role of PPARα-regulated dermatopontin[J].JCI Insight，2017，2（13）：e92264.

[15]Krishnaswamy VR，Balaguru UM，Chatterjee S，et al.Dermatopontin augments angiogenesis and modulates the expression of transforming growth factorβ1 and integrin α3β1 in endothelial cells[J].Eur JCell Biol，2017，96（3）：266－275.