miR-222-3p通過靶向調節Bim蛋白表達參與腎細胞癌的發生發展

田亞萍，王成，鐘錦莎，丁夢，葛京平，張春妮

（1.江蘇大學醫學院，江蘇鎮江212013；2.南京軍區南京總醫院臨床檢驗科，江蘇南京210002；3.南京軍區南京總醫院泌尿外科，江蘇南京210002）

腎細胞癌是常見的成人泌尿系統惡性腫瘤，發病機制至今不詳，早期多無癥狀，約30%的患者發現時已經發生轉移，導致預后極差[1]。故闡明腎細胞癌發生發展的分子機制，尋找新型的分子治療靶標，是提高腎細胞癌患者生存率和改善預后的關鍵。

微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）是一類小分子非編碼RNA，可通過與靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′端非翻譯區（3′-untranslated region，3′-UTR）完全或部分互補結合，導致靶mRNA翻譯抑制或降解，在轉錄后水平調控靶基因表達[2]。不同的miRNAs通過靶向不同的基因發揮原癌和抑癌基因作用，參與腫瘤的發生發展[3－4]。已有研究顯示，miR-222-3p在惡性甲狀腺濾泡癌水平升高，可用來區分良惡性甲狀腺濾泡癌[5]；在膠質細胞瘤中，miR-221/222通過與蛋白質酪氨酸磷酸酶 μ3′-UTR結合，下調該蛋白在膠質瘤中表達，進而誘導細胞的侵襲和遷移[6]；卵巢癌上皮細胞分泌的miR-222-3p可以促進單核細胞向腫瘤相關巨噬細胞轉化從而促進腫瘤的生長和轉移[7]。上述研究提示，miR-222-3p的表達異常與多種腫瘤發生發展密切相關。在miR-222-3p與腎腫瘤的研究中，已報道腎透明細胞癌患者血漿中miR-221/222的表達水平升高并且與其發生轉移有關，具體機制尚不清楚[8－9]。

Bim是細胞凋亡信號轉導途徑中關鍵的凋亡調節因子，是一種重要的促凋亡蛋白，研究發現Bim在多種腫瘤中發揮抑癌作用[10－11]。Terasawa等[12]發現miR-222通過在轉錄水平下調Bim的表達從而減少PC12細胞凋亡。然而miR-222-3p是否通過調節Bim的表達參與腎細胞癌的發生發展尚未見報道。因此本研究主要探討miR-222-3p在腎細胞癌組織中的表達變化、影響腎細胞癌的凋亡能力以及可能作用的靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本來源 收集15例2013年10月至2017年11月在南京軍區南京總醫院泌尿外科手術的腎細胞癌組織標本，患者平均年齡（63.47±2.99）歲，其中男10例，女5例，均無吸煙飲酒史。14例病理分型為腎透明細胞癌，1例為嫌色細胞癌。按照Furhman分級標準對患者組織標本進行分級[13]，其中Ⅰ～Ⅱ級 5例（33.3%），Ⅲ ～Ⅳ級 3例（20.0%），不確定7例（46.7%），均為新診治患者，行腎癌根治性切除術前未進行任何輔助治療。手術切除的腎癌組織留作本課題研究的腫瘤標本，同時在距腫瘤遠端約3～5 cm處切取正常組織作為對照。組織樣本取出后用液氮速凍，然后保存于－80℃冰箱。

1.1.2 細胞培養 人源腎癌細胞株769-P（北京協和細胞中心）和人胚腎細胞293T（上海中國醫學科學院細胞庫）分別培養于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的 RPMI1640、DMEM培養液，并于37℃濕潤的培養箱（5%CO2）以貼壁形式生長。

1.1.3 試劑與材料 miR-222-3p檢測探針（美國Applied Biosystems公司）；miR-222-3p模擬物（miR-222-3p mimic，序 列 為 5′-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-3′）和陰性對照寡核苷酸（miR-NC mimic，序列為 5′-UAGUGGAUGGCAGGCACACUCA-3′）由上海吉瑪生物公司合成；Bim mRNA定量檢測引物（前向引物 5′-CACCAGCACCATAGAAGAA-3′，后向引物 5′-ATAAGGAGCAGGCACAGA-3′）、GAPDH定量檢測引物（前向引物 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，后 向 引 物 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′）[14]、熒光素酶報告質粒（p-MIRLuciferase report）由金斯瑞公司合成；RIPA試劑（碧云天公司）；Bim抗體（Cell Signaling公司）；GAPDH、α微管蛋白、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗（Santa Cruz公司）；凋亡檢測試劑盒（美國Sigma-Aldrich公司）；熒光素酶報告系統檢測試劑盒（Promega公司）；Opti-MEM培養液、DMEM培養液、1640培養液和胎牛血清（Gibco公司）；Trizol試劑、Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）；SYBR Green試劑（大連TaKaRa公司）；ECL試劑盒（美國Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測腎組織miR-222-3p的表達組織總RNA用Trizol試劑提取。miR-222-3p檢測采用莖環qRT-PCR法。由于組織中常用內參miR-16、U6在癌及癌旁正常組織中表達均有差異（PmiR-16＜0.01，PU6＜0.01），miR-222-3p的表達由直接循環閾值法計算。

1.2.2 靶基因預測 應用TargetScan在線工具（http/www.targetscan.org/）尋找 miR-222-3p的可能作用靶基因。

1.2.3 熒光素酶活性檢測實驗 將293T細胞按每孔5×104個接種于48孔板中，當細胞匯合度為70%時，分別將 miR-NC mimic、miR-222-3p mimic、Bim野生型、Bim突變型、半乳糖苷酶表達載體（βgal）質粒共轉染293T細胞，培養6 h后換成含2%胎牛血清的DMEM繼續培養，48 h后檢測細胞熒光素酶的活性。β-gal為內參比較實驗組相對于對照組熒光素酶活性的變化。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測組織Bim蛋白的表達 采用 EnVision（DAKO公司）二步法[15]，抗體為Bim（1∶1 000）。使用 ImageJ-Pro Plus 6.0軟件分別計算癌組織及癌旁組織中200倍視野下Bim蛋白陽性顆粒數和總細胞數，陽性顆粒數與總細胞數之比為Bim相對表達水平。

1.2.5 蛋白質印跡法檢測組織Bim蛋白表達 采用RIPA裂解液提取癌組織及癌旁組織蛋白，配制12.5%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白加入梳孔進行電泳。電泳結束后轉印至PVDF膜，1.5 h后用5%的脫脂牛奶封閉，室溫1 h后加入一抗（Bim、GAPDH）4℃孵育過夜。TBST洗膜，二抗孵育1 h后用ECL試劑盒顯色發光。使用ImageJ軟件對結果進行灰度分析，計算蛋白表達水平。

1.2.6 蛋白質印跡法檢測轉染miR-222-3p后769-P細胞Bim蛋白表達 將769-P細胞按每孔5×104個接種在6孔板上，將200 pmol的 miR-NC mimic，miR-222-3p mimic用溶于Opti-MEM的Lipofectamine 2000試劑轉染769-P細胞，培養6 h后換成含2%胎牛血清的1640繼續培養48 h。收集細胞，用PBS洗滌2遍后提取總蛋白質。將蛋白提取液用12.5%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質轉至PVDF膜。用Bim、GAPDH單克隆抗體孵育過夜，TBST洗膜后二抗孵育1 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。使用ImageJ軟件對結果進行灰度分析。

1.2.7 qRT-PCR檢測轉染 miR-222-3p后769-P細胞中Bim mRNA的表達 Bim mRNA的定量PCR擴增使用SYBR Green試劑，GAPDH作為內參，其相對表達用2－ΔΔCT法表示，其中 ΔCT＝CtBim－CtGAPDH，ΔΔCT＝ΔCT腎癌組織－ΔCT癌旁組織。

1.2.8 流式細胞術檢測轉染 miR-222-3p后769-P細胞的凋亡水平 將769-P細胞按每孔5×104個接種在6孔板上，將200 pmol的 miR-NC mimic，miR-222-3p mimic用溶于Opti-MEM的Lipofectamine 2000試劑轉染769-P細胞，培養6 h后換成含2%胎牛血清的1640繼續培養48 h。將細胞用PBS洗滌2遍后，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI和Annexin-V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡。

1.3 統計學方法

所有數據應用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎細胞癌組織中miR-222-3p的表達水平顯著升高

qRT-PCR檢測結果顯示，腎細胞癌組織中miR-222-3p表達水平顯著高于癌旁對照組織（圖1）。

2.2 Bim是miR-222-3p的直接靶點

靶基因預測結果表明，miR-222-3p與促凋亡基因Bim mRNA 3′-UTR的第4052－4059位堿基序列（AUGUAGCA）互補結合（圖2），提示 Bim可能是miR-222-3p的靶點。

圖1 qRT-PCR檢測腎細胞癌組織和癌旁組織中m iR-222-3p的表達水平

為驗證Bim是miR-222-3p直接作用的靶基因，我們克隆了包含miR-222-3p結合位點的 Bim 3′-UTR序列，并將該序列插入到攜帶熒光素酶報告基因的質粒中，然后在人胚腎細胞293T進行了熒光素酶報告基因實驗。結果顯示，與miR-NCmimic和空載β-gal相比，轉染 miR-222-3p mimic和含有 Bim的3′-UTR區域的質粒后，熒光強度明顯降低（P＜0.01）。為進一步驗證miR-222-3p對含Bim 3′-UTR區的熒光活性的抑制是由于與該位點的結合所致，我們將Bim的3′-UTR區序列AUGUAGCA突變為UACAUCGA。同上述的轉染方法，同時轉染含有Bim的3′-UTR區域突變體質粒和化學合成的miR-222-3p mimic。結果顯示，與對照相比，熒光素酶活性沒有變化（圖3）。上述結果證明miR-222-3p通過特異性地識別并結合Bim的3′-UTR區域靶向調節Bim表達。

圖2 m iR-222-3p與Bim m RNA靶位點配對示意圖

圖3 熒光素酶活性檢測

2.3 Bim蛋白在腎細胞癌組織中表達明顯下降

免疫組化結果顯示，癌旁組織可見大量棕黃色顆粒，Bim蛋白表達強；癌組織中則分布少量或不可見的棕黃色顆粒，Bim蛋白表達弱（圖4）；光密度分析結果顯示，癌組織與癌旁組織之間Bim蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.01）。蛋白質印跡結果顯示，與癌旁組織相比，癌組織中Bim蛋白的表達明顯減低（P＜0.01，圖5）。說明 Bim蛋白在腎細胞癌組織中表達下調，這與miR-222-3p的表達水平相反。

圖4 免疫組化檢測腎癌組織Bim蛋白表達（×200）

圖5 蛋白質印跡檢測腎癌組織Bim蛋白表達

2.4 miR-222-3p降低769-P細胞Bim蛋白的表達

為進一步證實miR-222-3p對Bim的負向調控作用，在769-P細胞瞬時過表達miR-222-3p后，發現Bim蛋白水平明顯下調（圖6），而Bim mRNA水平無明顯變化（圖7），提示miR-222-3p對Bim的調控是經典的轉錄后水平調控。

2.5 miR-222-3p降低769-P細胞的凋亡水平

流式細胞術檢測結果顯示，與轉染 miR-NC mimic相比，轉染miR-222-3p mimic后769-P細胞凋亡水平明顯下降（圖8）。

圖6 瞬時過表達m iR-222-3p后769-P細胞Bim蛋白表達

圖7 瞬時過表達m iR-222-3p后769-P細胞Bim mRNA表達

圖8 Annexin V/PI染色法檢測769-P細胞的凋亡水平

3 討論

近年來對腎細胞癌相關miRNA差異性表達的研究揭示，miRNA與腎細胞癌密切相關，并在腎細胞癌發生發展中發揮重要的生理病理功能。Arai等[16]發現miR-10a-5p的低表達、紡錘體和著絲粒相關蛋白1（SKA1）的高表達與腎細胞癌患者的總生存率顯著相關。進一步實驗結果表明miR-10a-5p不僅可以下調SKA1的過表達，而且與腎細胞癌的發生和臨床酪氨酸激酶抑制劑治療抵抗緊密相關。我們課題組研究發現miR-28-5p通過抑制RAP1B（Ras相關的小 GTP結合癌蛋白）表達并影響RAP1B下游MAPK信號通路中的兩種激酶的活化對腎細胞癌的發生起促進作用[17]。研究報道miR-222-3p在腎透明細胞癌患者血漿中表達水平升高，是一個促癌miRNA[8]，但其在組織中的表達尚未見報道。本研究結果顯示腎細胞癌組織中的miR-222-3p表達水平明顯高于癌旁組織，進一步說明miR-222-3p在腎細胞癌發生發展中起促進作用。

miR-222-3p的生理病理功能并不完全清楚。有報道顯示，miRNA-19b/221/222可通過下調過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）的水平促進動脈粥樣硬化的形成，顯示miR-222-3p參與病理情況下血管結構變化的過程[18]。Nardelli等[19]通過芯片技術檢測肥胖妊娠和非肥胖妊娠婦女羊膜間質干細胞中多個miRNA的表達，發現miR-138/miR-222在肥胖妊娠婦女中高表達，這一結果提示可以通過改變飲食結構調整羊膜干細胞中miRNA的表達水平，為新生兒肥胖及肥胖相關代謝紊亂疾病提供新的治療思路。Terasawa等[12]則發現miR-222與PC12細胞凋亡有關。

Bim是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的一員，是一種重要的促凋亡蛋白。研究表明Bim表達的缺失與多種腫瘤的不良預后有關。表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑是一種用來治療有EGFR突變的晚期非小細胞肺癌患者的藥物，Zhao等[20]發現Bim缺失使其藥效降低。Maimaiti等[21]發現Bim表達缺失與乳腺癌尤其是luminal A型乳腺癌患者不良預后有關。Zantl等[22]發現Bim的丟失與腎細胞癌化療抵抗有關。這些研究充分說明Bim是一個重要的腫瘤抑制因子。本研究首先通過生物信息學方法發現miR-222-3p與Bim mRNA的3′-UTR有結合位點，并通過熒光素酶報告實驗證實miR-222-3p可以直接作用于Bim的3′-UTR序列。同時應用免疫組化和蛋白質印跡技術檢測了腎細胞癌組織中Bim蛋白表達情況，兩者結果均顯示Bim蛋白在腎細胞癌組織顯著降低，這與miR-222-3p的表達水平相反。進一步使用轉染技術實現769-P細胞過表達miR-222-3p，檢測769-P細胞Bim蛋白及mRNA的變化，證實miR-222-3p對Bim的調節是經典的轉錄后調控。凋亡實驗結果進一步說明miR-222-3p可以降低769-P細胞的凋亡水平，對腫瘤發生發展起促進作用。

綜上所述，本實驗結果揭示miR-222-3p是腎細胞癌中一個重要的促癌基因，通過下調抑癌基因Bim的表達抑制腎癌細胞的凋亡，參與腎細胞癌的發生發展。miR-222-3p/Bim軸為治療腎細胞癌提供了新思路。

[1]Siegel RL，Miller KD，Fedewa SA，et al.Colorectal cancer statistics[J].CA Cancer JClin，2017，67（10）：177－193.

[2]Ebert MS，Sharp PA.Roles formicroRNAs in conferring robustness to biological processes[J].Cell，2012，149（3）：515－524.

[3]Wolfson B，Eades G，Zhou Q.Roles ofmicroRNA-140 in stem cell-associated early stage breast cancer[J].World JStem Cells，2014，6（5）：591－597.

[4]Mo ZH，Wu XD，Li S，et al.Expression and clinical significance ofmicroRNA-376a in colorectal cancer[J].A-sian Pac JCancer Prev，2014，15（21）：9523－9527.

[5]Stokowy T，Eszlinger M，Swierniak M，et al.Analysis options for high-throughput sequencing in miRNA expression profiling[J].BMC Res Notes，2014，7：144.

[6]Quintavalle C，Garofalo M，Zanca C，et al.miR-221/222 overexpession in human glioblastoma increases invasiveness by targeting the protein phosphate PTPmu[J].Oncogene，2012，31（7）：858－868.

[7]Ying X，Wu Q，Wu X，et al.Epithelial ovarian cancersecreted exosomal miR-222-3p induces polarization of tumor-associated macrophages[J].Oncotarget，2016，7（28）：43076－43087.

[8]Teixeira AL，Ferreira M，Silva J，etal.Higher circulating expression levels ofmiR-221 associated with poor overall survival in renal cell carcinoma patients[J].Tumour Biol，2014，35（5）：4057－4066.

[9]Khella HW，Butz H，Ding Q，et al.miR-221/222 are involved in response to sunitinib treatment in metastatic renal cell carcinoma[J].Mol Ther，2015，23（11）：1748－1758.

[10]Letai A，Bassik MC，Walensky LD，et al.Distinct BH3 domains either sensitize or activatemitochondrial apoptosis，serving as prototype cancer therapeutics[J].Cancer Cell，2002，2（3）：183－192.

[11]Adams JM，Cory S.The Bcl-2 apoptotic switch in cancer development and therapy[J].Oncogene，2007，26（9）：1324－1337.

[12]Terasawa K，Ichimura A，Sato F，et al.Sustained activation of ERK1/2 by NGF inducesmicroRNA-221 and 222 in PC12 cells[J].FEBS J，2009，276（12）：3269－3276.

[13]Fuhrman SA，Lasky LC，Limas C.Prognostic significance ofmorphologic parameters in renal cell carcinoma[J].Am JSurg Pathol，1982，6（7）：655－663.

[14]Zhang H，Duan J，Qu Y，et al.Onco-miR-24 regulates cell growth and apoptosis by targeting BCL2L11 in gastric cancer[J].Protein Cell，2016，7（2）：141－151.

[15]Kosemehmetoglu K，Vrana JA，Folpe AL.TLE1 expression is not specific for synovial sarcoma：awhole section study of 163 soft tissue and bone neoplasms[J].Mod Pathol，2009，22（7）：872－878.

[16]Arai T，Okato A，Kojima S，et al.Regulation of spindle and kinetochore-associated protein 1 by antitumor miR-10a-5p in renal cell carcinoma[J].Cancer Sci，2017，108（10）：2088－2101.

[17]Wang C，Wu C，Yang Q，et al.miR-28-5p acts as a tumor suppressor in renal cell carcinoma formultiple antitumor effects by targeting RAP1B[J].Oncotarget，2016，7（45）：73888－73902.

[18]Xue Y，Wei Z，Ding H，et al.MicroRNA-19b/221/222 induces endothelial cell dysfunction via suppression of PGC-1αin the progression of atherosclerosis[J].Atherosclerosis，2015，241（2）：671－681.

[19]Nardelli C，Granata I，Iaffaldano L，etal.miR-138/miR-222 overexpression characterizes themiRNome of amniotic mesenchymal stem cells in obesity[J].Stem Cells Dev，2017，26（1）：4－14.

[20]Zhao M，Zhang Y，CaiW，et al.The Bim deletion polymorphism clinical profile and its relation with tyrosine kinase inhibitor resistance in Chinese patients with nonsmall cell lung cancer[J].Cancer，2014，120（15）：2299－2307.

[21]Maimaiti Y，Dong L，Aili A，et al.Bim may be a poor prognostic biomarker in breast cancer patients especially in those with luminal A tumors[J].Cancer Biomark，2017，19（4）：411－418.

[22]Zantl N，Weirich G，Zall H，et al.Frequent loss of expression of the pro-apoptotic protein Bim in renal cell carcinoma：evidence for contribution to apoptosis resistance[J].Oncogene，2007，26（49）：7038－7048.