霉菌和酵母菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

劉 桐，劉 爽，司 南，苑 帥，任大勇，陳 萍

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春，吉林 130118）

0 引言

霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)用來測定食品被污染的程度，是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量必不可少的指標(biāo)[1]。霉菌和酵母菌的污染會導(dǎo)致食品營養(yǎng)價(jià)值下降、腐敗變質(zhì)。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，會造成腸胃不適，引起疾病發(fā)生。霉菌對于食品的最大風(fēng)險(xiǎn)能產(chǎn)生有毒代謝產(chǎn)物——霉菌毒素，引起各種急、慢性中毒，并可能致癌。因此，人們愈來愈重視食品中霉菌和酵母菌污染對人體造成的危害。在我國飲料、堅(jiān)果制品、米面制品、糕點(diǎn)類等食品中，把霉菌和酵母菌作為食品污染的指示菌進(jìn)行監(jiān)測，被列入國標(biāo)GB 4789系列食品安全微生物常規(guī)檢測項(xiàng)目之一[2]。目前國內(nèi)對霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)檢測仍采用國標(biāo)的平板檢測法，雖然檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但程序復(fù)雜、檢測周期過長。對當(dāng)前國內(nèi)外霉菌和酵母菌的檢測技術(shù)現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為研究出更高效的霉菌和酵母菌檢測技術(shù)研究提供參考。

1 霉菌和酵母菌概述

霉菌和酵母菌都是真菌，與人們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系十分密切。霉菌不僅應(yīng)用于傳統(tǒng)的釀酒制醬和發(fā)酵食品中，在農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥和皮革制造等領(lǐng)域都起著極為重要的作用。但是，有些霉菌（黃曲霉、灰綠曲霉、綠青霉等）能在食品谷物上生長并產(chǎn)生真菌毒素。其中，黃曲霉毒素有明顯的致癌作用，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康[3]。常見的霉菌有毛霉菌、根霉菌、曲霉、青霉等9類。現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)對糧食造成污染的霉菌有150多種，檢測糧食中的霉菌，對于指導(dǎo)糧食儲備、保護(hù)人類和動物飲食安全意義重大[4]。酵母菌在釀造、食品、醫(yī)藥工業(yè)等方面占有重要地位。酵母菌有1 000多種，與食品有關(guān)的酵母菌主要有假絲酵母、啤酒酵母、面包酵母等[5]。致病性的酵母菌含量過高會引起深部真菌感染。因此，對食品中霉菌和酵母菌數(shù)量的監(jiān)測是十分必要的。

2 霉菌和酵母菌檢測技術(shù)的現(xiàn)狀

國內(nèi)外目前對霉菌、酵母菌的檢測方法主要有平板檢測法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法和測試片法。根據(jù)GB 4789.15—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，平板計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，取一定量的稀釋液接種到平板上，培養(yǎng)基為孟加拉紅或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數(shù)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確[6]。但平板法也有很多缺點(diǎn)，如需要培養(yǎng)時(shí)間長，霉菌前期生長緩慢，后期菌絲過度生長蔓延影響計(jì)數(shù)。

顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物顯色的原理來檢測微生物的新型培養(yǎng)基，利用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的篩選和分離。Zhao L等人[7]用顯色培養(yǎng)基Candi Select 4對非白假絲酵母念珠菌屬物種進(jìn)行鑒別，該顯色培養(yǎng)基特異性高，其中白色念珠菌特異性為100%，而克柔念珠菌為100%，熱帶假絲酵母99.8%，光滑假絲酵母95.7%。Ghelardia E等人[8]用CCA顯色培養(yǎng)基對521株酵母菌進(jìn)行分離鑒定，培養(yǎng)基的敏感性和特異性均超過99.4%。Yucesoy M等人[9]用Chromogenic Candida Agar，BiGGY瓊脂和白色念珠菌ID2瓊脂3種顯色培養(yǎng)基推定鑒定215酵母菌株，敏感性和特異性分別為100%和100%，91%和92.7%，99.2%和92.7%。張志強(qiáng)等人[10]應(yīng)用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基對120份婦科門診病人分泌物標(biāo)本進(jìn)行念珠菌的分離培養(yǎng)，與常用的沙氏培養(yǎng)基比較。以沙氏培養(yǎng)基為參照，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基的靈敏度87.5%，特異度89%，符合率88.3%，2種培養(yǎng)基具有相同的檢出率（χ2=0.07，p＞0.05），有很好的特異度和符合率。胡錫池等人[11]應(yīng)用科馬嘉顯色培養(yǎng)基對250份樣本進(jìn)行酵母菌鑒定時(shí)經(jīng)VITEKYBC卡確認(rèn)后總的符合率94.6%。顯色培養(yǎng)基雖然改進(jìn)了傳統(tǒng)培養(yǎng)基在生化鑒定方面的不足，但仍需要樣品前處理和滅菌等過程，培養(yǎng)時(shí)間長。

WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測系統(tǒng)以計(jì)算機(jī)處理系統(tǒng)為核心，結(jié)合生物制片技術(shù)、光學(xué)顯微鏡、圖像采集裝置，用分類器進(jìn)行模式識別檢測出目標(biāo)微生物的數(shù)量，并進(jìn)行自動計(jì)數(shù)。鄭東輝[12]用孔徑為3 μm的混合纖維素微孔濾膜對酸奶中的霉菌和酵母菌進(jìn)行富集，滴加次甲基藍(lán)染色液染色，制成涂片后在微生物快速檢測儀中進(jìn)行檢測。此方法檢測酵母菌的檢測范圍為2～1×106CFU/mL，霉菌的檢測范圍為2～1×105CFU/mL，此方法與國標(biāo)法檢測結(jié)果無差異顯著性。這2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，二者具有良好的相關(guān)性。雖然此方法檢測時(shí)間短，但對操作人員要求高，后期處理復(fù)雜，成本高。

流式細(xì)胞儀是一種對細(xì)胞或生物粒子的結(jié)構(gòu)、功能及相互間作用進(jìn)行多參數(shù)分析的儀器檢測技術(shù)。該技術(shù)無需增菌，直接對食品中的活菌數(shù)進(jìn)行檢測，可檢測出1個(gè)活的微生物或活細(xì)胞，并在90～100min內(nèi)出檢測結(jié)果，已廣泛應(yīng)用于水、液態(tài)加工食品、飲料等行業(yè)。劉道亮等人[13]采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測飲料中的霉菌和酵母菌，流式細(xì)胞儀檢測果汁樣品中霉菌、酵母菌的檢出限為10 CFU/mL。流式細(xì)胞儀檢測霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)與平板計(jì)數(shù)線性相關(guān)系數(shù)分別為0.999 7，0.999 9，有很好的符合性。但此方法只用于液體食品的檢測，有一定的局限性。

測試片是指以滅菌濾紙、無紡布或冷水可溶凝膠等吸收培養(yǎng)基作為載體，將特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)附著在載體上面，通過微生物在其上面的生長、顯色情況來測定食品中微生物的一種產(chǎn)品[14]。在戴昌芳等人[15]的研究中將順德萬家康科技實(shí)業(yè)公司生產(chǎn)的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測試紙片與國標(biāo)法檢測效果進(jìn)行比較，2種方法檢測樣品的符合率高達(dá)99.47%，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著性差異 （χ2=1，p＞0.05）。余淑冰等人[16]將銳朗霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測試片與國標(biāo)法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，霉菌和酵母菌檢出結(jié)果差異無顯著性（p＞0.05），總符合率96.20%。張建明等人將其實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的測試片與3M霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)測試片的檢測效果進(jìn)行了評價(jià)，2種紙片的生長率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.399），2種測試片和霉菌、酵母菌的生長率均達(dá)到 0.9以上。Teramura H等人[17]將 SkYM（Sanita-kun R公司的霉菌和酵母測試片）、DRBC（NISSUI制藥有限公司的孟加拉紅培養(yǎng)基）、PYM（3M公司的霉菌和酵母菌測試片）、CDYM（NISSUI制藥有限公司的霉菌和酵母測試片） 4種產(chǎn)品用于100種自然污染食品中霉菌和酵母菌的檢測。SkYM（48 h） 與DRBC，PYM，CDYM的線性相關(guān)系數(shù)分別是 0.921，0.929和 0.947，而 SkYM（72 h） 和DRBC，SkYM，CDYM之間的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.948，0.877和0.911。測試片法雖然成本低、檢測性能好，但霉菌菌絲的蔓延和顯色效果的不穩(wěn)定性影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性，也需進(jìn)一步研究解決這些問題。

3 霉菌和酵母菌顯色計(jì)數(shù)測試片的研究

測試片是一項(xiàng)微生物快速檢測新方法，它由上下2層薄膜組成，下層的聚乙烯薄膜上印有網(wǎng)格并且覆蓋有微生物生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基，其中加入染色劑、顯色劑，增強(qiáng)菌落的目視效果；上層是聚丙烯薄膜并加入冷水可溶凝膠。使用方法簡單方便，檢樣直接接種測試片，適宜溫度培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。

霉菌和酵母菌測試片研究的關(guān)鍵是對霉菌和酵母菌特異選擇培養(yǎng)基中顯色劑的研究。霉菌和酵母菌有復(fù)雜的酶系統(tǒng)和代謝過程，有多種的顯色原理與顯色底物可以研究來實(shí)現(xiàn)對霉菌和酵母菌顯色計(jì)數(shù)測試片的研究。微生物具有復(fù)雜多樣的酶系統(tǒng)，胞內(nèi)酶的種類及反應(yīng)條件可作為微生物分類鑒定的重要依據(jù)。根據(jù)酶的特征設(shè)計(jì)對微生物進(jìn)行快速檢測的一種方法，基本原理是：在分離培養(yǎng)基中加入檢測某些菌種的特異性酶底物，該底物為人工合成，由產(chǎn)色基團(tuán)和微生物可代謝物質(zhì)組成，通常為無色，但在特異性酶作用下游離出發(fā)色基團(tuán)并顯示一定顏色，直接觀察菌落顏色即可對菌種做出鑒定，這種顯色底物就是顯色劑。食品中霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)PetrifilmTM測試片法中添加5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸為指示劑。SkYM測試片中添加2-（2-甲氧基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四氮唑?yàn)轱@色劑，使霉菌和酵母菌生成紅色菌落[17]。吳清平等人也做了相關(guān)研究。在Albicans ID瓊脂平板上，該顯色培養(yǎng)基加入特異性顯色底物己糖胺，白假絲酵母呈現(xiàn)光滑的藍(lán)色菌落。CDA顯色培養(yǎng)基，加入顯色底物VLPA-GLcNAC 0.32 g/L。檢測原理是以菌株產(chǎn)生的葡糖胺酶催化特異性的底物VLPAGLcNAC水解而顯色。王則宇自制念珠菌顯色培養(yǎng)基中的顯色劑為N-甲吲哚-N-乙酰-β-D-氨基己糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-吡咯磷酸脂和甘氨酸-L-精氨酸-L-精氨酸-對硝基萘胺。通過這3種顯色底物的聯(lián)合使用，可以有效地對念珠菌直接鑒別。趙貴明研制的一種新型念珠菌顯色培養(yǎng)基中使用的顯色底物為5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-乙酰基-β-D-氨基半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃葡糖苷，可以將都柏林念珠菌與白色念珠菌區(qū)分開。念珠菌顯色培養(yǎng)基CCA中加入5-溴-4-氯-3-吲哚基/N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚基磷酸對甲苯胺鹽作為顯色底物[8]。而霉菌與酵母菌顯色計(jì)數(shù)測試片的研究還需解決酵母菌生長顯色所需時(shí)間長、顯色劑不能指示所有的霉菌和酵母菌菌落導(dǎo)致漏計(jì)等問題。

4 結(jié)語

霉菌和酵母菌的檢測技術(shù)還有很大的提升空間。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)，霉菌和酵母計(jì)數(shù)中的方法也只是平板計(jì)數(shù)。雖然國內(nèi)外都建立了很多霉菌和酵母菌的檢測方法，但都存在很多問題。最關(guān)鍵的問題是霉菌菌絲過度蔓延生長影響計(jì)數(shù)、檢測周期長，這是當(dāng)今和未來研究需要解決的問題。在未來是試驗(yàn)研究中需要不斷地探索和努力來研究出更方便快捷的檢測技術(shù)，才會讓人類吃上安全、健康的食品，這對人類社會的發(fā)展是至關(guān)重要的。

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