山葡萄酒釀造工藝及其香氣成分GC-MS分析

彭彰文，徐天豪，譚新佳，羅思浩，陳 芳，吳竹青，2

（1.吉首大學植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室，湖南吉首 416000；2.吉首大學食品科學研究所，湖南吉首 416000）

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）是無污染野生的山葡萄，不僅含有多種氨基酸，還含有VB1，VB2，VPP，VC，胡蘿卜素等多種微量元素。此外，山葡萄酒還富含黃酮類化合物，可預防動脈硬化癥和癌癥[1-3]。野生的山葡萄，葡萄果粒小、皮厚、色素濃、酸度高、糖度低、單寧含量高，與野生的靈芝、人參一樣，營養成分非常豐富，故其市場價值極大[4-6]。

山葡萄酒品質獨特，山葡萄酒的傳統文化源遠流長、歷史悠久。武陵山區的居民，長期保持著用山葡萄做酒的習慣。每到秋天，山葡萄熟了，家家自釀山葡萄酒，春節期間用來招待客人，山葡萄酒果香撲鼻、醇和酸澀。國內外當前對于山葡萄酒研究不多，這主要是由于大眾對山葡萄酒認知度和研究時間不足，對其研究深度和廣度不夠，且對其特征的香氣成分有待進一步驗證。李華等人[7]報道了葡萄酒香氣成分的氣相色譜分析，研究得出了葡萄酒香氣成分氣相色譜分析方法的最新研究進展。陶永勝等人[8]采用“電子鼻”等非色譜方法分析葡萄酒香氣的特點，闡述了葡萄酒香氣成分氣相色譜分析的不同檢測器方法。現階段，對于葡萄酒香氣成分的分析多采用以氣相色譜為代表的色譜技術，氣相色譜-質譜聯用（GC-MS） 通過色譜的高分離能力和質譜的高鑒別特性，可一次性完成對復雜的混合樣品進行分離、定性和定量分析，是一種較完美的現代分析方法[9-10]。

開展山葡萄酒釀造工藝及香氣成分變化研究旨在為山葡萄酒釀造提供參考，并通過對山葡萄酒釀造和貯藏過程中香氣成分變化進行詳細分析，以準確控制山葡萄酒的品質。一方面，實現了對山葡萄酒品質的深入分析，為葡萄酒的生產工藝提供有價值的參考資料；另一方面，武陵山區山葡萄酒的開發，符合當今市場化趨勢，具有一定的市場開發價值，同時有利于推動武陵山區的經濟發展。

1 試驗部分

1.1 主要試劑與儀器

山葡萄，購于吉首市農貿市場，經測定新鮮山葡萄糖度在18%左右；安琪活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司提供；葡萄糖、蔗糖、偏重亞硫酸鉀、殼聚糖等，均為市售食品級。

FA2004型電子天平、722型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；7890A-5975C型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司產品；固相微萃取進樣器及萃取纖維頭，美國Supelco公司產品。

1.2 工藝流程及操作要點

1.2.1 山葡萄酒精發酵工藝流程

新鮮山葡萄→清洗→除梗、破碎→加偏重亞硫酸鉀、果膠酶→加入活化酵母酒精發酵→壓榨、分離→后發酵→倒罐→蘋果酸-乳酸發酵→陳釀→澄清處理→過濾→殺菌→灌裝、封口→山葡萄酒→檢驗→成品。

1.2.2 操作要點

（1） 原料選用及預處理。采用吉首市山葡萄，采摘時糖度積累要達到18%～22%（手持糖量計測定），含酸量在0.6～1.2 g/100 mL較合適，色素含量高，風味濃郁、典型，無病蟲害，果膠酶添加量0.1%～0.2%，酶解溫度30～35℃，保持3 h后于73℃條件下進行消毒30 s，然后加入固體偏重亞硫酸鉀120 mg/L，使得二氧化硫含量為 40～80 mg/L（GB/T 27586—2011），再根據所需酒精度進行糖度和酸度的調整。

（2）干酵母活化。按試驗用量稱取活性干酵母，在超凈工作臺內將安琪酵母加到無菌水（按1 g/mL溶解） 中，在38～43℃的水浴中保持30 min后活化完成，將活化好的酵母液冷卻至30℃以下備用。

（3）酒精發酵。將活化后的酵母添加到葡萄汁中。為了充分浸漬皮渣上的色素、單寧及芳香成分，要將皮渣壓入葡萄醪中，皮渣很厚并且往往浮在葡萄汁上，與空氣直接接觸，易感染有害雜菌，此時應將發酵液從桶底放出，用泵將其噴淋在皮渣上，每天1～2次，亦可用壓板將皮渣壓在液面下30 cm左右，然后進行壓榨分離。

（4）壓榨分離。山葡萄酒帶渣壓榨，當主發酵完成后及時壓榨取出新酒，采用自流酒（不加壓流出）繼續進行試驗。

（5）陳釀。將山葡萄酒置于橡木桶中，并在通風良好的環境中進行陳釀，陳釀溫度12～15℃，環境相對濕度85%～90%，陳釀時間6個月以上。

1.3 山葡萄酒香氣成分的GC-MS分析

（1）山葡萄酒樣品處理。運用頂空固相微萃取法[11-12]萃取山葡萄果酒香氣成分，取山葡萄酒樣5 mL于15 mL頂空瓶中，加入1.2 g NaCl，封口，于40℃條件下在磁力攪拌器上平衡20 min，插入老化后的萃取纖維頭吸附45 min，于進樣口解析5 min后，采集數據。

（2） 色譜條件。色譜柱選擇 Agilent190191S-433型石英毛細管（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣（He） 流量1.0 mL/min；進樣口溫度250℃；不分流進樣，程序升溫：起始溫度35℃，保持5 min，以5℃/min升至110℃，保持2 min，以6℃/min升至150℃，保持2 min，以8℃/min升至220℃，保持10 min。

（3） 質譜條件。四極桿溫度150℃，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，離子化方式EI，分辨率1 000，質量范圍30～500 U/s。

1.4 山葡萄酒釀造試驗

1.4.1 山葡萄酒精發酵單因素試驗

選取酵母菌接種量、發酵溫度、發酵時間、發酵pH值為考查因素，以山葡萄酒酒精度為評價指標，進行單因素試驗，探究各因素對山葡萄酒精發酵的影響。

1.4.2 山葡萄酒酒精發酵正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以酒精度作為評判指標，把酵母菌接種量、發酵溫度、發酵時間、發酵pH值作為考查因素，進行四因素三水平正交試驗，確定山葡萄酒精發酵的最佳工藝條件。

1.5 感官評價

評價指標采用感官綜合評分，選擇師生共10人組成評價小組，對山葡萄酒樣品的色澤、口感、體態、風味等進行評價（100分計），取其平均值作為樣品的最終得分。

山葡萄酒感官品質綜合評分標準見表1。

1.6 數據分析

正交試驗結果及驗證性結果用SPSS 20.0統計軟件處理，結果表示為平均值±標準偏差（X±S）。方差分析比較用t檢驗，p<0.05時為顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 山葡萄酒精發酵單因素試驗

2.1.1 發酵溫度對山葡萄酒精發酵效果的影響增強，酒精度呈上升趨勢，當pH值超過3.4時，酵母菌活性降低，酒精度開始下降且在pH值為3.4時酒精度最大。因此，酵母發酵pH值應以3.4左右為宜。

表1 山葡萄酒感官品質綜合評分標準

2.1.3 酵母菌接種量對山葡萄酒精發酵效果的影響

取100 mL葡萄糖汁置于250 mL錐形瓶中，發酵pH值3.2，發酵溫度28℃，分別加入果汁用量0.04%，0.06%，0.08%，0.10%，0.12%，0.14%，0.16%的活化酵母，恒溫發酵60 h。測量酒精度，研究酵母菌接種量對山葡萄酒精發酵的影響。

酵母菌接種量對山葡萄酒精發酵的影響見圖3。

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發酵pH值3.2，分別在溫度22，24，26，28，30，32，34℃下恒溫發酵60 h。測量酒精度，研究發酵溫度對山葡萄酒精發酵的影響。

發酵溫度對山葡萄酒精發酵的影響見圖1。

圖3 酵母菌接種量對山葡萄酒精發酵的影響

圖1 發酵溫度對山葡萄酒精發酵的影響

由圖1可知，當發酵溫度超過22℃時，山葡萄酒精度隨發酵溫度增加而顯著增加，并在發酵溫度為30℃取得最大值；當發酵溫度超過30℃后，山葡萄酒精度呈下降趨勢，故發酵溫度以30℃左右為宜。

2.1.2 發酵pH值對山葡萄酒精發酵效果的影響

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發酵溫度28℃，分別調節pH 值為 2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，恒溫發酵60 h。測量酒精度，研究發酵溫度對山葡萄酒精發酵的影響。

發酵pH值對山葡萄酒精發酵的影響見圖2。

圖2 發酵pH值對山葡萄酒精發酵的影響

由圖2可知，隨著發酵pH值增加，酵母菌活性

由圖3可知，酵母菌接種量0.04%～0.10%的范圍內，山葡萄酒精度隨酵母菌接種量增加而呈上升趨勢，酵母菌接種量在0.10%時，山葡萄酒精度達到最大；當酵母菌接種量超過0.10%后，山葡萄酒精度開始下降。因此，酵母菌接種量以0.10%左右為宜。

2.1.4 發酵時間對山葡萄酒精發酵效果的影響

取100 mL山葡萄汁置于250 mL錐形瓶中，固定酵母菌接種量0.10%，發酵溫度28℃，發酵pH值3.2，分別恒溫發酵 24，36，48，60，72，84，96 h，測量酒精度，研究發酵時間對山葡萄酒精發酵的影響。

發酵時間對山葡萄酒精發酵的影響見圖4。

圖4 發酵時間對山葡萄酒精發酵的影響

圖4 結果表明，在發酵時間為24～72 h時，發酵液中氧氣含量充足，酵母菌代謝旺盛，山葡萄酒精度隨發酵時間的增加而增加，當發酵時間為72 h時，山葡萄酒精度達最高；發酵時間超過72 h后，山葡萄酒精度呈緩慢下降趨勢。因此，發酵時間應在72 h左右為宜。

2.2 山葡萄酒精發酵正交優化試驗

在單因素試驗基礎上，以酒精度作為評價指標，以酵母菌接種量、發酵溫度、發酵時間、發酵pH值為考查因素，選擇較優因素，即發酵溫度28，30，32℃，發酵pH值3.0，3.2，3.4，酵母菌接種量0.10%，0.15%，0.20%，發酵時間48，60，72 h，通過L9（34）正交試驗對發酵條件進行優化。

正交因素與水平見表2，正交試驗結果與分析見表3，正交試驗方差分析結果見表4。

表2 正交因素與水平

表3 正交試驗結果與分析

表4 正交試驗方差分析結果

由表2可以看出，D＞A＞C＞B，正交試驗的各因素水平中發酵時間、發酵溫度、酵母菌接種量、發酵pH值對山葡萄酒精發酵的影響是依次減小的。由表3可知優水平組合為A2B3C2D3，即酵母菌接種量0.15%，發酵pH值3.4，發酵溫度30℃，發酵時間72 h。在此優化工藝條件下，山葡萄發酵液酒精度實測值為8.4%（V/V），感官評分實測值為83分。

2.3 山葡萄酒香氣成分GC-MS分析結果

該試驗主要是對山葡萄發酵酒及發酵酒貯藏3個月、貯藏7個月酒樣進行了GC-MS分析。

新山葡萄酒樣香氣成分總離子流色譜圖見圖5，陳釀3個月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖見圖6，陳釀6個月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖見圖7，山葡萄酒香氣成分分析見表5。

圖5 新山葡萄酒樣香氣成分總離子流色譜圖

圖6 陳釀3個月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖

圖7 陳釀6個月山葡萄酒香氣成分總離子流色譜圖

表5 山葡萄酒香氣成分分析

（續表5）

在貯藏過程中，其香氣成分中的醇類酯類物質變化較大，隨著陳釀時間的進行，3-甲基-1-丁醇由8.718%增加到24.478%，壬酸乙酯由2.389%增加到4.547%，其他物質含量沒有大的波動。因此，山葡萄酒在釀造過程中的主要香氣成分主要為壬酸乙酯、3-甲基-1-丁醇，同時乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯類和醇類物質也對酒液香氣有重要貢獻。

在葡萄酒生產中，醇類和酯類化合物是葡萄酒酵母發酵過程中的主要產物，對葡萄酒的香味具有重要影響，適量的高級醇可以給葡萄酒帶來良好香氣，酯類和酸類等化合物含量的不同使葡萄酒在風味上產生很大的差別。在武陵山葡萄酒釀造和陳釀過程中，醇類與酯類物質變化較大，這與發酵的工藝條件和陳釀的溫度、容器等有關，但是對香氣物質在發酵和山葡萄酒陳釀過程中的相關生理和化學變化的機理尚不明確。因此，對加強儀器功能及效率提出了新要求，對香氣物質變化機理探討、掌握葡萄及發酵過程中香氣成分的形成機制問題，還有待進一步深入研究。

3 結論

以武陵山地區山葡萄為原料，研究山葡萄酒釀造工藝和陳釀過程中香氣成分的變化。在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優化得到山葡萄酒發酵工藝最優參數，即酵母菌接種量0.15%，發酵pH值3.4，發酵溫度30℃，發酵時間72 h。在此優化工藝條件下，山葡萄發酵液酒精度實測值為8.4%（V/V），所得山葡萄酒色澤呈深紅色，酸味協調且具山葡萄獨特風味，清香爽口，略帶澀味，感官評分實測值為83分。

山葡萄酒陳釀過程中香氣成分變化，對山葡萄酒的風味口感有著很重要的影響，通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術，分析了新釀制山葡萄酒、山葡萄酒陳釀3個月和6個月香氣成分的變化情況。結果表明，山葡萄酒在釀造過程中，醇類與酯類的變化較大，其中主要香氣成分為壬酸乙酯和3-甲基-1-丁醇，同時乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙醇等酯類和醇類物質也是構成山葡萄酒香氣成分的重要組成部分。

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