山羊MSTN基因研究及其在甘肅本地山羊的應用

楊軍祥

（甘肅省畜牧獸醫研究所 744000）

轉化生長因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)超家族成員廣泛分布于脊椎動物體內[1]，在調節骨骼肌發育和維持機體穩態方面發揮重要的作用，該家族成員主要包括TGF-β抑制素、TGF-β活化素等。

肌肉生長抑制素 （myostatin，MSTN）在1997年被美國科學家McPherron首次發現，屬于生長分化因子β超家族成員。MSTN是近年來發現具有負向調控作用的因子，該基因的突變可使MSTN活性降低或者喪失，從而促使骨骼肌更好地生長發育，出現 “雙肌臀”。目前，研究人員已經根據該基因培育出了經濟效益佳的肉畜品種，如作為終端父本的 “雙肌臀”肉牛，在生產中產生了巨大的經濟效益，具有瘦肉率高、飼料報酬好和生長速度快等特點。

中國是世界上山羊存欄量最多的國家，也是世界上最大羊肉生產國。山羊以天然草料為主食，其肉質好、蛋白含量豐富、能量低，富含多種氨基酸和微量元素，且膽固醇含量低。畜產品瘦肉率的提高和肉品質的改善有利于優化人們的膳食結構，尋找與畜禽生長性狀和肉質性狀相關的候選基因或遺傳標記，對品種改良具有重要意義。本文從山羊MSTN基因的結構、生物學特性、功能及作用機制等方面的研究進展入手，探尋MSTN基因與山羊生長性能及經濟性狀的關系，為甘肅本地山羊種質資源保護、開發和利用開辟新的途徑。

1 MSTN基因的結構

MSTN基因的cDNA（complementary DNA）是由1個可讀框和能編碼376個氨基酸的脫氧核糖核苷酸堿基序列構成，其中外顯子3個、內含子2個，而成熟區是其第3外顯子。MSTN基因具有TGF-β超家族成員的典型結構特征，即由52ku的前體蛋白質N-末端區和編碼12.5ku成熟肽的C-末端區構成[2]，在N-末端區與C-末端區之間存在1個蛋白酶解加工位點，經過2次蛋白酶解加工，除去信號多肽，切除前體蛋白質生成N-端前肽與C-端多肽，而C-端多肽又以—S—S—(二硫鍵)鍵相連形成二聚體，構成MSTN成熟蛋白分泌至血液循環，并與N-端前肽以非共價鍵形式形成LAP。

除以上所述之外，MSTN基因與TGF-β超家族成員還有下面4個共同點：（1）在信號肽的N-末端區附近有一個氨基酸殘基構成的疏水前體蛋白質核心； （2）MSTN蛋白質靠C-末端區的中間部位有一個保守的蛋白酶解加工信號 （RSSR，263-266位氨基酸）； （3）9個半胱氨酸殘基在C-末端區形成 “Cys Knot”結構； （4）分子之間的二硫鍵均能聚合形成二聚體，并和細胞膜上的受體結合，通過3種Sand蛋白介導，將信號傳入細胞，作用于靶基因的調控區。

Thomas等利用MSTN特異性抗體，在牛成肌細胞培養物的提取液中檢測到52ku的前體蛋白質、40ku的LAP，但沒有檢測到加工后的活性蛋白，這可能是因為成熟的活性蛋白被分泌到血液的緣故[3]。但在骨骼肌提取物中檢測到26ku的活性蛋白。而McPherron等則報道在CHO細胞表達的重組MSTN前體蛋白和成熟的活性蛋白分別為52和12ku，這種分子質量的差異可能是由于翻譯后修飾造成的[2]。

Gonzalez-Cadavid等證實，人的MSTN基因也由3個外顯子和2個內含子組成，位于染色體2q33.2，含有3個轉錄起始位點，轉錄產物為3.1kb的mRNA，編碼375個氨基酸的前體蛋白[4]。Ma等克隆了人MSTN基因包括5′端調控區在內的全長3.3kb片段，結果發現，MSTN啟動子序列含有對多種物質的生長反應元件，這些物質包括糖皮質激素、肌生長分化因子1、肌細胞增強因子2、核因子-B等，并發現在體外，地塞米松以一種劑量依賴的方式不僅可增強MSTN啟動子的轉錄活性且可增強內源性MSTN基因的表達[5]。

2 MSTN基因的生物學功能

MSTN基因的功能主要體現在抑制肌肉增肌和脂肪積累兩個方面，其具體的生物學功能包括以下幾個方面。

（1）MSTN基因對肌肉的生長起負向調控作用即抑制肌肉生長。Mcpherron利用基因敲除技術證明了MSTN基因突變后的小鼠肌肉重量增大[2]。目前已有學者研究證實，牛MSTN基因可以改變肌肉的組織構造，把MSTN基因鈍化，使骨骼和皮下脂肪間的肌肉相互抑制作用減弱 (即骨骼肌的激增)，因為未成熟的終止密碼子和蛋白的無功能表達引起1個多肽的平截，使MSTN基因不能被表達為功能蛋白質，從而出現臀部、胸及其中前端肌肉異常發達，且皮膚較薄的 “雙肌臀現象”。

（2）MSTN基因與肌肉再生有一定的關系。Wagner等利用MSTN基因完全突變的小鼠與肌肉萎縮型小鼠雜交發現，MSTN基因完全缺失的肌肉萎縮型小鼠與非缺失的萎縮性小相比更為強壯、肌肉更多，肌肉間的隔膜表現出更少的纖維樣變形，這表明MSTN基因缺失對肌肉再生有促進作用[6]。Taylor等用重組MSTN基因對鼠骨骼肌C2C12細胞進行檢測，結果表明，重組MSTN蛋白在C2C12肌細胞中能抑制或阻礙細胞的增生、DNA合成和蛋白質合成，證明MSTN基因可能通過抑制肌肉的再生控制肌肉的生長[7]。

（3）MSTN基因能使肌肉萎縮。Gilson等通過研究人慢性廢用性肌肉萎縮中MSTN基因mRNA的表達水平發現，大多數病人的MSTN基因mRNA表達水平比正常人顯著高，同時其表達量與2A、2B型纖維量成反比，因此，得出MSTN基因是促使肌肉萎縮的因子[8]。

（4）MSTN基因抑制脂肪沉積。Zimmers等研究發現，給裸鼠腿部注射能穩定表達MSTN的CHO細胞后，裸鼠全身骨骼肌出現萎縮現象，體內的白色脂肪也差不多完全消失，說明MSTN基因不僅能抑制肌肉的生長，還能參于體內脂肪的代謝，抑制脂肪積累，這在生產中有利于提高瘦肉率[9]。

3 MSTN基因多態性的研究進展

目前的研究結果表明，MSTN基因的功能在不同動物間高度保守。Lee將小鼠MSTN的保守C-末端編碼序列作為探針，對小鼠、大鼠、人、牛、豬、羊、雞、火雞、斑馬魚的MSTN cDNA進行克隆、測序，研究發現，各種動物的MSTN基因序列高度保守，其N-末端都有分泌必需的信號肽序列，都有類胰蛋白酶作用水解加工位點 (RSRR)，都含有TGF-β超家族的富含半胱氨酸的保守區，且小鼠、大鼠、人、豬、雞、火雞的水解加工位點后的C-末端序列完全一致，同源性為100%，而牛、綿羊的成熟蛋白中也僅有l～3個。

劉錚鑄等采用限制性內切酸酶Mnl I對山羊MSTN基因的379bp的擴增產物進行PCR-SSCP多態性分析，證實山羊內含子2、外顯子3區域存在多態性[10]。孟詳人等利用PCR-RFLP技術對11個綿羊品種MSTN基因非編碼區進行多態性分析，發現存在3種基因型CC型、CT型和TT型，且3種基因型在11個綿羊品種中的分布差異極顯著 （＜0.01）[11]。劉錚鑄等采用PCR和直接測序的方法對我國9個地方綿羊品種和1個引入品種共計60個個體進行MSTN基因內含子2和外顯子3的多態性檢測及單倍型分析，共發現15SNPs，全部存在于內含子2中，同時檢測到12種單倍型，并推測單倍型VIII可能與綿羊的產肉性能有關[12]。朱紅剛等采用PCR-RFLP方法對67只貴州小香羊MSTN基因內含子2和外顯子3進行了多態性分析[13]。結果表明，所擴增內含子2中存在Bsp1286I的酶切多態位點，共檢測到3種基因型AA型、AB型、BB型，其中AB為優勢基因型；所擴增內含子2和外顯子3中存在BstBI酶切多態位點，雜合型 （CD）為優勢基因型，純合野生型 （CC）和純合突變型 （DD）為非優勢基因型，D等位基因為優勢基因。

由此可見，山羊的MSTN基因與其他動物MSTN基因相似，具有一定程度的保守型，其多態性主要集中在內含子2和外顯子3區域，該基因對于家畜肌肉的生長影響較大。

4 MSTN基因調控機制的研究

MSTN基因對肌肉生長負調控的作用機制至今尚未完全清楚，目前的研究結果認為，其作用機制有以下途徑。

根據TGF-β超家族成員信號傳導途徑，推測MSTN基因抑制肌肉生長的作用機理：MSTN基因在信號轉導過程中需要Ⅰ型 （TβRⅠ）和Ⅱ型 （TβRⅡ）受體的異二聚體復合物。MSTN基因C-端的半胱氨酸二聚體首先與TβRⅡ型受體結合，然后再與TβRⅠ型受體結合，于細胞表面處形成異源聚合體，通過TβRⅡ型受體激酶的活性，導致TβRⅠ型受體CT區域發生磷酸化，活化的TβRⅠ型受體可暫時與胞漿內Smads家族中的Smad2、Smad3結合，并激活C-端SSXS區域使絲氨酸殘基發生磷酸化。最后與無磷酸位點Smads家族中的Smad4形成異源聚合物，進入細胞核中，導致生肌調節因子MyoD磷酸化過程受阻，阻止了與E-box位點的結合，這個E-box位點是其堿性區域和位于成肌細胞調控區內肌動蛋白啟動子的轉錄因子的結合位點，干擾有活性MyoD-E-box形成特定的肌肉蛋白質，從而抑制成肌細胞向肌細胞分化，阻礙肌肉的形成。

5 MSTN基因在甘肅本地山羊種質資源保護和開發利用上的前景

隴東黑山羊是甘肅省優良的地方山羊品種，具有抗逆性強（耐寒、耐旱），肉質優良 （羊肉鮮嫩，膻味輕，口感佳），適應性好 （耐粗放管理、耐粗飼）等優點。隴東白絨山羊是以隴東黑山羊為母本，引進遼寧絨山羊和內蒙古白絨山羊做父本，經過長期的雜交選擇培育而成的以絨用為主的山羊品種。近年來，由于盲目引種和放任本交，使得隴東黑山羊和隴東白絨山羊的血統混雜、生產性能嚴重退化，純種飼養量下降，甚至處于瀕危狀態，種質資源保護迫在眉睫。為了保護、開發、利用這些優良的地方品種，基層畜牧工作者和科研人員進行不懈的努力，隨著現代生物技術的普及、地方畜牧從業者理論技術的提升和基礎條件的改善，利用分子標記技術進行優勢基因發掘和種質資源保護也提上了日程。

MSTN基因是調控肌肉生長發育的重要功能基因，也是重要經濟性狀的候選基因，具有廣闊的應用前景，其多態性與生產性能的關系等已成為當前的研究熱點。因此，在隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質資源保護、開發、利用上，可以利用分子標記輔助選擇技術，研究其純種個體及其與布爾山羊等優秀肉用山羊雜交后代MSTN基因的多態性和生長發育、產肉性能之間的關系，分析其群體遺傳結構，并確定其對羔羊體重、體尺及屠宰性能的影響，確定最佳雜交改良方案。同時，篩選出MSTN基因突變的個體，通過培育選擇出產肉率高、肉品質好和飼料報酬率高的優秀個體作為種畜進行推廣，深度發掘地方優良品種潛力，為隴東黑山羊和隴東白絨山羊種質資源保護、開發、利用工作開辟新的途徑。