人乳頭瘤病毒致皮膚腫瘤機制的研究進展

朱宸樸 黃 丹 陳 崑

HPV是一種環狀雙鏈DNA病毒，其基因組主要由三個部分組成，即早期基因、晚期基因、上游調節區。E6、E7基因組位于早期基因區，該區還編碼E1～E5及E8六個蛋白，與E6、E7配合共同參與HPV病毒DNA的復制、轉錄、蛋白合成。晚期基因主要編碼L1和L2，構成病毒蛋白衣殼，而上游調節區則參與病毒復制轉錄的調控[1]。目前HPV的分類方式有兩種，一種是按其致病性分為低危型HPV與高危型HPV；還有一種是按照L1蛋白核酸序列的不同可分為16個屬，α和β-HPV是其中最為常見的[2]。就致病性而言，低危型HPV如HPV6、11主要引起上皮細胞良性增生，導致尖銳濕疣、角化型棘皮瘤等；而高危型HPV如HPV16、18則能引起諸多惡性腫瘤，與皮膚相關的主要有皮膚鱗狀細胞癌(cquamous cell carcinoma, SCC)、皮膚基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)，鮑恩病(bowen diease，BD)等。目前越來越多的皮膚腫瘤生成被證實與HPV相關，新的機制被不斷發現，本文就一些新的研究進展做一綜述。

1 HPV感染與皮膚腫瘤的臨床關聯

高危型HPV主要引起非黑色素瘤皮膚癌(nonmelanoma skin cancer, NMSCs)。流行病學調查顯示，在NMSCs 中，BCC是最常見的皮膚惡性腫瘤，SCC次之；BD屬于原位SCC，可發展為侵襲性SCC[3]。

針對HPV與皮膚腫瘤的臨床關聯，國內外均進行了相關流行病學研究，在國內，一些學者進行了臨床調查，選取50例AK、20例SCC、50例BCC，72例SK及80名正常皮膚進行β-HPV檢測，結果顯示β-HPV檢出率分別為80%、75%、44%、29%、35%， 經統計學分析：AK、 SCC中β-HPV陽性率遠高于對照組，P值均小于0.05，OR值AK為8.75，SCC為5.469[4]。在一項252例皮膚鱗狀細胞癌的病例對照研究中，患者血清HPV抗體檢出率也明顯高于對照組，β-HPV被認為是該病的重要致病因素，且合并多型感染使患病風險增加。在器官移植后患者中，β-HPV血清抗體和毛發中同型病毒DNA陽性人群患皮膚SCC的風險也會增加，主由HPV-5、9、24、36等高危型HPV引起[5]。

國外大部分調查顯示：HPV抗體的血清學檢出與BCC、SCC的關聯較弱，但針對于BCC與SCC的組織活檢，HPV的檢出率是相當高的。北歐一組大型臨床血清學抗體檢測對633例SCC患者及1990例BCC患者的血清學樣本進行了16種HPV病毒的抗體檢測(HPV-3，5，6，11，15，16，18，31，32，33，38，45，52，58，68及76型)，結果顯示：HPV-5，HPV-15，HPV-38與BCC具有弱關聯性；HPV-5，HPV-6與SCC風險相關[6]，但也是弱關聯，考慮到樣本量較大，這種關聯可能意義不大。挪威還進行了HPV-16及18型的前瞻性血清學檢測，實驗選取了856,000名獻血者的血清，并篩選出在30年后發NMSCs的樣本，結果顯示：HPV16和18與SCC的風險增加有關(OR，1.6；95%CI，1.1-2.6)，而BCC沒有相關性[7]。

關于活檢組織中HPV的檢測，國外的一項臨床研究顯示，在BCC患者及SCC患者的活組織中，黏膜型HPV均未檢出，而β-HPV的檢出率分別為78%及55%。進一步深入的調查指出：1型β-HPV在BCC中的檢出率顯著高于其他型別(P=0.022)，在SCC中則無顯著差異(P=0.091)。此外，患者年齡越高與β-HPV陽性率有顯著關聯OR=4.88(95%CI1.29-18.39)，而性別、皮膚部位和紫外線暴露則未見明顯相關[8]。

2 HPV感染的基本過程

HPV是唯一的上皮內病毒，其感染和病毒生長絕對依賴于完整的角化細胞分化程序。在皮膚損傷情況下，HPV病毒通過皮膚中的微擦傷到達基底上皮細胞層，并可特異性達到毛囊，在其中定植，起到了類似HPV病毒“蓄水庫”的作用。發生感染事件后，HPV會進行一輪獨立于細胞周期的自我復制，產生大約五十至數百個病毒拷貝，隨后受感染細胞進入分化時期，病毒復制隨之大規模上調，每份產生大約數千個病毒拷貝[9]，整個過程需要三周到數月。眾所周知，HPV的復制僅限于最上層分化上皮，這勢必要求HPV須具有一定的機制來保證其在復制過程中具有充足的底物。細胞學實驗表明：HPV陽性細胞具有增加dNTP池和RRM2水平的能力，RRM2是用于從頭合成dNTPs所需的核糖核苷酸還原酶復合物的重要組成部分。HPV早期可通過激活ATR-Chk1-E2F1 DNA損傷反應來上調RRM2水平，保證HPV在連續復制的過程中具有充足的物質儲備[10]。此外，α6β4整聯蛋白受體(α6β4 Integrin receptor)以及生長因子被認為在HPV的感染過程也具有一定作用[11]。

3 HPV的致癌作用

3.1 HPV所致表皮細胞早期致癌事件 最近一系列研究表明，高危型HPV在感染的早期階段，就可引起一系列的基因、轉錄因子及蛋白的改變，加強HPV的致癌作用，主要改變為：①抑制表皮的分化功能：表皮細胞的連續分化是限制致癌變的重要途徑，關鍵驅動基因(如TP53和NOTCH1)決定著連續分化細胞的比例。有臨床研究證實：HPV16感染后的角質形成細胞的分化能力隨著腫瘤級別的提高而下降，從而證實了HPV病毒可抑制表皮的分化功能而增強癌變進程；此外HPV-16感染后的角質細胞培養進一步證實了腫瘤的進展與p53和NICD1的進行性喪失有關[12]。②改變表皮間連接蛋白的功能：細胞學實驗表明，β-catenin和ZO-1是致癌性β-HPV 5型E7的直接靶標。β-catenin是一種鏈蛋白，其功能主要為介導細胞間黏附和參與基因的表達，而ZO-1蛋白作為緊密蛋白家族的一員主要能維持細胞極性，參與物質轉運，同時兼有調節細胞分化的作用。HPV可直接抑制這些上皮連接蛋白的能力，使得表皮細胞侵襲性增加，從而增加其在人體皮膚中的致癌潛力[13]。③與PML-NB(promyelocytic leukemia protein-Nuclear body )協同作用：PML-NB是一種腫瘤抑制蛋白，具有許多調節性細胞功能，包括參與程序性細胞死亡，基因組穩定性，抗病毒作用和控制細胞分裂。HPV病毒對于細胞的感染在起始階段可以PML核體作為目標-細胞學實驗表明：使用h-RNA敲低HaCaT角化細胞中的PML蛋白，HPV-16的轉錄顯著增加了，這說明HPV感染在早期對PML-NB的抑制與表皮細胞的癌變相關[14]。

3.2 HPV所致氧化應激內環境的致癌作用 HPV的感染是一個慢性持續性的過程，其慢性炎癥將導致細胞具有持續性的氧化應激內環境，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)家族異常生成，上皮細胞DNA發生氧化損傷。這種氧化應激還會使DNA錯配修復(mis-match repair，MMR)系統失活，DNA復制錯誤不斷積累，最終導致基因組不穩定，中心體擴增過程與細胞周期解耦聯，中心體無序擴增，數目發生異常改變，同時紡錘體功能受損，染色體錯誤分離與非整倍體發育，基因的完整性進一步被破壞，上皮細胞發生惡變[15]。這種內環境還會導致Nox1異常，Nox1是Nox (NADPH oxidase) 家族的一員，具有誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的能力，它會使上皮細胞喪失其細胞極性和細胞黏附性，并獲得遷移和侵入性，大大加速了癌變進程[16]。最新的細胞學實驗指出，E6/E7及E1/E2蛋白在細胞ROS水平的調節及DNA損傷方面起到的作用是不同的。E6蛋白能顯著上升ROS的水平，并能耗竭還原型谷胱甘肽(GSH)，降低超氧化物岐化酶(superoxidedismutase，SOD)，過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性。SOD、CAT、POD是機體內天然存在的超氧自由基清除因子，三種酶可組成一個完整的防氧化鏈條，把有害的超氧自由基轉化為完全無害的水，其活性的降低將導致攻擊性氧自由基的濃度大大增加，DNA發生畸變。而與E6蛋白相反，E7蛋白反而能導致GSH活性的上升，這說明了E7蛋白在炎性致癌機制中可能并不起作用，甚至起負作用。而E1/E2蛋白則能聯合作用，升高ROS的水平，研究發現，單一的E1與E2蛋白在氧化應激過程中起到的作用不大[17]。

3.3 HPV編碼相關蛋白所致的表皮細胞癌變機制

3.3.1 E6蛋白促使表皮細胞癌變機制 E6蛋白主要分布于宿主細胞的細胞核與細胞膜中，含151個氨基酸，已具有2個共同的(Cys-x-x-Cys)鋅指結構作為特征。α-HPV和β-HPV的主要差異是E6蛋白C末端PDZ基序是否缺乏4-氨基酸結構，這個結構能夠結合含PDZ結構域的蛋白質而促進細胞侵襲[18]。既往研究認為，E6蛋白主要通過抑制p53引起表皮細胞分化異常，P53蛋白的失活使得多種癌基因表達異常；同時組蛋白乙酰轉移酶P300/CBP也發生異常，大量積累的DNA復制錯誤不能修復，染色體不穩定，細胞周期自發的越過G1/S期檢驗點，表皮細胞持續性增殖[19]。除此之外，端粒酶的改變可促進上皮腫瘤形成也已獲得共識，myc基因與人端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的改變被認為在癌變進程中起到主要作用[20]。

最新的研究表明,導致多種信號通路的紊亂是E6蛋白致癌的主要機制，以信號通路可能具有特征性： 1.PI3K/Akt/mTOR通路：磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)蛋白家族主要參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。HPV病毒可通過與α6β4整聯蛋白受體或生長因子相互作用進入宿主上皮細胞，并通過其介導的PI3K/Akt/mTOR信號通路促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。此通路中，Akt信號分子起著關鍵作用，Akt能通過磷酸化P53結合蛋白 MDM2影響P53的活性，磷酸化的MDM2轉位到細胞核與P53結合，P53降解失活，從而導致細胞發生惡變[11]。最近的動物學實驗表明，強化了E6/E7基因表達的小鼠模型，可迅速發展為SCC，這其中mTOR最為重要。盡管單純的E6/E7基因表達不能直接導致mTOR的過表達，但是當有致癌物質諸如二羥甲基丁酸DMBA的刺激下，E6/E7基因可導致mTOR強烈的過表達，從而使SCC迅速進展[21]。2.Caspase家族信號通路：Caspases是一組結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，它們能特異性識別蛋白上的某些位點并對其進行切割，誘導細胞的程序性凋亡(programmed cell death，PCD)。E6蛋白可通過抑制死亡受體的激活如TNFR1、Fas/CD95等，使得活化下游Caspase家族信號通路障礙，上皮細胞凋亡受阻而發生永生化[22]。3.Notch和TGF-β信號通路：動物實驗表明，用鼠乳頭瘤病毒(Mouse papillomavirus，mmupv1)感染實驗小鼠可使皮膚疣進展為鱗狀細胞癌，這可能與mmupv1具有綁定maml1和Smad2/Smad3轉錄輔因子的能力，從而影響Notch和TGF-β信號通路，導致細胞的延遲分化和持續增殖有關。人體實驗證明，與mmupv1類似，HPV8 E6亦可抑制 Smad2/3的磷酸和核轉位以及TGF-β核復合體裝配，從而干擾了TGF-β誘導的角質形成細胞生長的能力及其轉錄活性，最終導致細胞的無序增殖[23]。

影響mi-RNA在近期的研究中也被認為是E6蛋白促使表皮細胞癌變的重要機制：microRNA-203(miR-203)是表皮增殖和分化的關鍵控制因子，HPV感染上皮的基底角化細胞后可使其失去其增殖潛力并經歷終末分化，這個過程就是由miR-203控制。最新的細胞學研究表明，miR-203在HPV8陽性的EV病變中強烈下調[24]，并且此過程可能是由E6蛋白介導，因為miR-203在角質形成細胞中的主要靶標是轉錄因子p63及p53家族的成員，如ΔNp63α等。p53家族的作用上文已有敘述，而ΔNp63α主要在維持角質形成細胞“干細胞”和增殖能力中起關鍵作用，且可以抑制角質細胞分化，他的異常將顯著導致癌變進程。此外，miR-203的調節主要受CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)控制，眾所周知， C/EBPα是角質形成細胞分化的驅動劑，因其在EV病變中它呈現出強烈原位染色，我們認為他是HPV8 E6蛋白調控miR-203表達的的新靶標[22]。

E6蛋白還可對抑癌性蛋白因子產生抑制作用，具有特征性的主要為：①PDZ蛋白：PDZ蛋白泛指包含了PDZ結構域的一類蛋白，包括PSD95、Zol、DLG-A等，其具有細胞信號傳導、蛋白框架組裝，抑制腫瘤活性的作用。E6蛋白一方面能夠通過C端的高度保守序列直接與PDZ蛋白結合，通過蛋白酶體途徑使其失活，另一方面可通過PKA或AKT磷酸化阻斷PDZ蛋白的表達，從而增加表皮細胞腫瘤的發生發展[25]。②NFX1-91蛋白：NFX1-91是一類特異性轉錄阻遏蛋白，E6蛋白可降解NFX1-91導致mSin3A/HDAC復合體從hTERT啟動子解離，誘導hTERT轉錄，這是HPV誘導的惡性腫瘤的關鍵步驟[25]。

E6蛋白還可直接抑制細胞凋亡，其主要作用靶點為Bak蛋白、Fas相關的死亡結構域FADD、生存素[25]。

3.3.2 E7蛋白促使表皮細胞癌變機制 E7蛋白主要存在于宿主細胞的細胞質中，是由98個氨基酸組成的一種磷酸化蛋白。E7蛋白分為三個域，命名為保守區域1～3(CR1～3)。 E7的CR2結構域含有LXCXE基序，其介導與pRb蛋白及其相關蛋白-p107和p130的相互作用[21]。既往研究認為，E7蛋白主要通過抑制Rb蛋白來擾亂細胞周期。E7可通過與蛋白酶體結合靶向降解pRb，使上皮細胞周期進程可以在沒有促有絲分裂信號的情況下發生，從而導致細胞過度生長，同時上皮細胞自發跨越過G1/S檢驗點而發生無序增殖和永生化[26]。可以說E2F/Prb系統是各種信號通路的終末端，在E7蛋白的致癌過程中發揮最為重要的作用[22]。此外，亦有文獻指出，在β-HPV中， E7蛋白可通過刺激形成轉錄抑制性復合物ΔNp73α來影響p53通路，進而導致細胞癌變[27]。

多種信號通路的紊亂也是E7蛋白致癌的主要機制，以下信號通路被認為是新熱點：①TGF-β信號通路[1]：與E6蛋白類似，E7蛋白介導的TGF-β信號通路的抑制將會促進上皮細胞的無序增殖。E7消除TGF-β的能力主要取決于LXCXE基序和CR1。首先，E7可導致SMAD的破壞，從而抑制TGF-β驅動的基因表達。其次，E7可以依賴于CR2和CR3結構域的方式抑制TGF-β2啟動子。有研究指出E7可能還有抑制TGF-β I型受體基因的作用，雖然精確的機制目前尚未明確。②IFN信號通路[1]：IFN具有促進病毒整合，降低病毒轉錄水平的作用， IFN信號通路的異常可大大增加HPV的單位濃度，從而增加其致癌效力。E7蛋白具有多種機制來下調IFN反應機制。正常情況下，干擾素反應因子(IRFs)負責驅動IFN基因的表達。隨后IFN結合相應受體，信號轉導和轉錄激活因子(STAT)家族被激活以促進干擾素刺激基因(ISGs)的表達，產生抗病毒反應。 E7蛋白可以綁定IRF1和招募HDACs到IRF1依賴啟動子，包括MHC-1和TAP1，產生抑制作用；E7蛋白也可抑制IRF1 DNA結合活性，同時干擾激活IRF的信號。此外有細胞學實驗證明HPV31 E7可以抑制STAT1的轉錄水平，導致IFN介導的基因表達減少。

mi-RNA也是E7蛋白致上皮細胞腫瘤的重要機制：研究指出，E7蛋白可顯著影響miR-21和miR-143的轉錄，從而影響細胞分化進程。目前的觀測發現E7蛋白可導致miR-21發生轉錄上調，miR-143發生轉錄下調。在轉基因小鼠模型中，miR-21的轉錄上調及miR-143的轉錄下調抑制了PTEN和Bcl-2基因，從而誘發上皮細胞永生化[1]。E7蛋白還可與肌球蛋白1C(nuclear myosin 1C)結合，影響rRNA的裝配，核肌球蛋白1C是RNA聚合酶I轉錄酶的一個重要組成部分，E7蛋白與其結合后，前rRNA的表達降低，而成熟細胞質18S和28SrRNA的表達水平被保留，這就使HPV的復制更為節能，大大加速了其致癌進程[28]。

E7蛋白還可使上皮細胞腫瘤發生免疫逃逸：正常情況下，人體免疫系統具有抗腫瘤性，可對異常的腫瘤細胞進行限制和殺傷。E7蛋白可顯著抑制此種效應，導致上皮細胞腫瘤免疫逃逸而加速癌變進程，其可能途徑主要是通過抑制 MHC I類基因。細胞學實驗表明：MHC I類基因的表達在HPV陽性角質形成細胞中下調，這種下調是以依賴E7的方式進行的。同時在NIKS-16細胞中HLA-E基因附近的遠端CpG島(CGI)呈現出高甲基化，HLA-E蛋白表達的啟動被抑制。HLA-E可通過調節自然殺傷和CD8+T細胞在抗病毒免疫中起重要作用，這種抑制效應大大增加了HPV持續性期間的病毒免疫逃避[29]。

擾亂染色體復制過程中的關鍵步驟-中心體的組裝也被認為是E7蛋白的致癌機制之一，E7刺激的細胞周期蛋白/CDK2活性改變與異常中心體形成密切相關。此外，也有報道稱持續的RNA pol II介導的基因轉錄是HPV-16 E7誘導的中心粒過度重復所必需的[25]。

3.3.3 其余蛋白所致的表皮細胞癌變 在上皮細胞向腫瘤細胞轉換的過程中，E6與E7起到主導作用，但是E1、E2、E5蛋白，乃至HPV的保守序列編碼的L1、L2衣殼蛋白都參與到這一過程中，E5蛋白目前被認為是一種原癌蛋白，本身具有致癌性，而E1-2/L1-2蛋白主要作用是輔助E6、E7蛋白，造成DNA的損傷。

①E1/E2蛋白：最新的細胞學與組織學實驗顯示，E1 mRNA隨著SCC的進展，呈現出與疾病進展相關的高表達(r=0.661，P=0.019)，且p97和p670啟動子的甲基化水平也隨之發生相應的升高，這就說明了E1蛋白可能通過影響原癌蛋白p97和p670從而來導致SCC的進展[30]。E2蛋白則被認為主要起到抑制E6、E7蛋白復制的作用，當E6、E7基因整合入宿主細胞基因后，這種抑制作用被解除，E6、E7的翻譯大大增加。此外，還有研究表明， E1與E2蛋白可與DDR相關蛋白相互作用，DDR是一類細胞DNA損傷后的修復機制，其受損將促進病毒復制，誘導細胞惡變[21]。②E4蛋白：有研究表明，E4蛋白主要在HPV感染早期呈現出高表達，并隨之影響下游的△Np63與MCM7蛋白的表達。△Np63作為p63蛋白的關鍵組分，其作用不言而喻，而MCM7蛋白是微型染色體維持蛋白(mini-chromosome maintenance proteins )家族的重要成員，在真核細胞的復制起始、調節CDK4的活性，與腫瘤抑制蛋白RB1/RB的結合等各方面起到重要作用，是細胞增殖的標志物之一，其高表達可能與細胞異常增殖相關[31]。③E5蛋白：E5蛋白能夠抑制血管生成基因EGFR的降解，一方面E5蛋白與V-ATPase的16-kda亞基結合抑制EGFR的降解，同時E5也能通過阻斷EGFR的泛素化而抑制其降解。EGFR被認為是腫瘤發生發展過程中的重要促成因素，他的高表達大大增加了腫瘤的進展[22]。此外，E5蛋白還能與E6、E7蛋白協同，下調鈣黏蛋白的表達，促進腫瘤細胞的轉移與浸潤。④衣殼蛋白L1/L2：衣殼蛋白由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2組成，L1占總量的80%～90%[32]。L1蛋白可以自發重組成具有高度免疫原性的結構，參與到DNA的包裝、轉運；病毒對新宿主細胞的附著，以及DNA整合入宿主細胞的全過程中。研究表明，L1蛋白與宿主細胞的作用始于L1與蛋白多糖硫酸肝素(proteoglycans HS)碳水化合物的相互作用，這種作用使次要衣殼蛋白L2的氨基末端部分發生暴露，從而允許病毒結合角質形成細胞表面的受體(如α6β4整聯蛋白受體)，最終進入宿主細胞導致一系列的致癌過程[33]。

4 結語

HPV致皮膚腫瘤的機制迄今為止已有許多研究。一般認為，E6/E7蛋白所致的P53及Rb蛋白失活是各類致癌機制中最為重要的。此外HPV較為簡單的基因組序列，獨特的感染及復制方式，經久不愈的慢性炎癥，應激性的細胞內環境，各類轉錄產物的協同作用都有助于癌變的進展。目前各種新的致癌性信號通路及機制仍在不斷發現中，為將來開發預防和治療HPV感染相關疾病的藥物提供更多靶點。