正交試驗優(yōu)化頭孢噻肟鈉原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查中溶液制備條件

張濤，豆東海，楊鵬波（.安陽市食品藥品檢驗檢測中心，河南安陽455000；.河南康達(dá)制藥有限公司，河南周口 46600）

頭孢噻肟鈉屬于第三代頭孢菌素類衍生物，對革蘭氏陰性菌的抗菌活性高于第一代和第二代，因其耐酶和廣譜的特點而在臨床上廣泛使用[1]，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國藥典》（二部）[2]。筆者依照《中國藥典》檢驗標(biāo)準(zhǔn)對頭孢噻肟鈉原料藥進(jìn)行質(zhì)量分析時，發(fā)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)檢查重復(fù)性較差，結(jié)果不穩(wěn)定。筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[3-6]，發(fā)現(xiàn)放置時間、放置溫度、磷酸鹽緩沖液pH、光照這4個因素均對溶液穩(wěn)定性有較大影響，單因素考察試驗顯示隨著供試品溶液放置時間增加、試驗溫度提高、磷酸鹽緩沖液pH增加、光照強(qiáng)度增加這些因素的改變，頭孢噻肟鈉原料藥雜質(zhì)總量會變化；但未見有綜合上述4個因素進(jìn)行影響分析的報道。鑒于此，筆者采用單因素和正交試驗法，以該原料藥中的雜質(zhì)總量為指標(biāo)，優(yōu)化有關(guān)物質(zhì)檢查中溶液的制備條件，以期為完善該原料藥有關(guān)物質(zhì)檢查方法提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2030C型高效液相色譜（HPLC）儀，包括自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測器（日本Shimadzu公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HYC-390 2～8℃海爾醫(yī)用冷藏箱（青島海爾公司）；Labonce-380GS 4～65℃恒溫箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

頭孢噻肟鈉原料藥（河南某制藥廠，批號：201160701、201160702、201160703）；頭孢噻肟系統(tǒng)適用性對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130619-201402）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為實驗室純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)檢查

2.1.1 色譜條件的確定 色譜柱：Hypersil ODS2（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：流動相A為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（取7.1 g無水磷酸氫二鈉至1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，用磷酸調(diào)節(jié)pH為6.50）-甲醇（86∶14，V/V），流動相B為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為6.50）-甲醇（60∶40，V/V）；進(jìn)樣時，均先以流動相A-B（95∶5，V/V）等度洗脫，待頭孢噻肟峰洗脫完畢后再進(jìn)行梯度洗脫（梯度洗脫程序：0～2 min，95%→75%A；3～8 min，75%A；9～23 min，75%→0 A；24～28 min，0 A；29～33 min，0→95%A；34～43 min，95%A）；檢測波長：235 nm；柱溫：5 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 ①供試品溶液。取樣品原料藥25.10 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用置于冰箱中降溫到5℃的流動相A為溶劑進(jìn)行溶解并定容。溶解過程中，應(yīng)避光操作，供試品溶液溫度應(yīng)盡量保持5℃。②系統(tǒng)適用性對照品溶液。取頭孢噻肟系統(tǒng)適用性對照品25.14 mg，置于25 mL棕色量瓶中，用置于冰箱中降溫到5℃的流動相A為溶劑進(jìn)行溶解并定容，即得。③空白溶液。取空白溶劑適量為空白溶液。

2.1.3 系統(tǒng)適用性試驗 取“2.1.2”項下溶液各適量，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果主峰與各雜質(zhì)峰、各雜質(zhì)峰間均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5，色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 單因素試驗

2.2.1 放置時間 取“2.1.2”項下供試品溶液（批號：201160701）適量，分別于放置5、30 、60、120 、240 min時按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，放置時間與雜質(zhì)總量的關(guān)系見圖2。由圖2可知，雜質(zhì)總量隨著時間的遞增呈上升趨勢，但在60 min后雜質(zhì)總量增加變平緩，所以取5、30、60 min為考察因素。

圖2 放置時間Fig 2 Standing time

2.2.2 放置溫度 取“2.1.2”項下供試品溶液（批號：201160701）適量，分別放置于5、15、25、35、45 ℃環(huán)境中，各按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，放置溫度與雜質(zhì)總量的關(guān)系見圖3。由圖3可知，雜質(zhì)總量隨著放置溫度的增加呈上升趨勢，但在35℃以后雜質(zhì)總量增加變平緩，所以取5、15、30℃為考察因素。

圖3 放置溫度Fig 3 Placing temperature

2.2.3 磷酸鹽緩沖液pH 精密稱取樣品原料藥（批號：201160701）適量，按2015年《中國藥典》（二部）[2]現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢查項操作制成單因素試驗溶液，流動相A為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（取7.1 g無水磷酸氫二鈉至1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，用磷酸分別調(diào)節(jié)pH為6.0、6.25、6.5、7.0、7.25）-甲醇（86∶14，V/V）；流動相B為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（用磷酸分別調(diào)節(jié) pH 為 6.00、6.25、6.50、7.00、7.25）-甲醇（60∶40，V/V），供試品溶液中磷酸鹽緩沖液的pH也相應(yīng)變化；檢測波長：235 nm；試驗環(huán)境及樣品溫度：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。并按“2.1.1”項下梯度洗脫程序進(jìn)行梯度洗脫，按上述條件測定雜質(zhì)總量，結(jié)果見圖4。由圖4可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖液pH為6.00～7.25時，雜質(zhì)總量降低，但考慮到甲醇也呈堿性，所以流動相A和B混合后流動相pH會接近8，達(dá)到了常規(guī)色譜柱的高限，所以取pH為6.0、6.25、6.5為考察因素。

圖4 磷酸鹽緩沖液pHFig 4 pH value of phosphate buffer solution

2.2.4 光照條件 分別在避光環(huán)境下（1）、棕色量瓶（2）、正常環(huán)境（3）下，按“2.1.2”項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液（批號：201160701），再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，光照條件與雜質(zhì)總量的關(guān)系見圖5。由圖5可知，雜質(zhì)總量隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)呈上升趨勢。所以取避光環(huán)境、棕色量瓶、正常環(huán)境為考察因素。

圖5 光照條件Fig 5 Illumination condition

2.3 正交試驗

2.3.1 正交試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以頭孢噻肟鈉含量（%）為指標(biāo)，對磷酸鹽緩沖液pH（A）、放置溫度（環(huán)境溫度及溶液制備時溫度）（B）、供試品溶液從制備完成到進(jìn)樣前的放置時間（C）以及光照條件（D）4個因素進(jìn)行考察，各因素均取3個水平（見表1），L（934）正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2（表中雜質(zhì)總峰面積＝總峰面積－主峰面積）；方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實驗因素與水平Tab 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Variance analysis results

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 由表2可知，影響因素主次順序為B＞C＞D＞A，各因素水平較優(yōu)的搭配是A3B1C1D2，即供試品溶液制備時溶液溫度為5℃時（HPLC儀帶柱溫箱和放置溫度取同樣水平），5 min內(nèi)進(jìn)樣，試驗過程避光操作，磷酸鹽緩沖液的pH為6.50。

2.3.3 驗證試驗 取3批樣品適量，按2015年《中國藥典》（二部）的方法和本文優(yōu)化的方法進(jìn)行試驗，結(jié)果見表4。由表4可知，正交試驗結(jié)果可靠。

表4 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of the relevant substances in the sample（n＝3，%）

3 討論

3.1 評價指標(biāo)的選擇

溫度、濕度、日光、空氣等外界條件會引起藥物發(fā)生水解、氧化、分解、異構(gòu)化等變化，使藥物產(chǎn)生有關(guān)物質(zhì)[6]，導(dǎo)致主成分含量降低而雜質(zhì)總量增加，因此可以以雜質(zhì)總量[即雜質(zhì)總峰面積/總峰面積（%）]為評價指標(biāo)優(yōu)選頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)檢查中的溶液制備條件。

3.2 有關(guān)物質(zhì)對照品

我國頭孢噻肟鈉現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)檢查是不加校正因子的自身對照法，且我國只發(fā)行了頭孢噻肟對照品和頭孢噻肟系統(tǒng)適用性對照品（混合有關(guān)物質(zhì)對照品和主成分對照品），未對頭孢噻肟鈉原料藥及分析中可能存在的單個有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，有關(guān)物質(zhì)檢查以有關(guān)物質(zhì)峰面積及雜質(zhì)總峰面積和頭孢噻肟主峰面積進(jìn)行比較。

3.3 方法學(xué)說明

由于沒有單一有關(guān)物質(zhì)對照品，在本研究優(yōu)化過程中未作單一有關(guān)物質(zhì)的含量測定及線性考察。還因本試驗對頭孢噻肟鈉有關(guān)物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了單因素考察，數(shù)據(jù)表明隨試驗時間變化，穩(wěn)定性有所改變，所以在本研究優(yōu)化過程中未再對穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

3.4 其他

本試驗在模擬光照因素時使用的是玻璃量瓶，紫外線不能穿透玻璃容器，沒有完全模擬純紫外線影響。在質(zhì)量分析工作中，應(yīng)盡量避免稱量、過濾等步驟中樣品完全暴露在日光下，以免紫外線影響。

綜上所述，優(yōu)化后的方法重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

[1]張海濤.頭孢噻肟鈉結(jié)晶技術(shù)研究[D].天津：天津大學(xué)，2008.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：286-297.

[3]劉海燕，蔣紅霞.關(guān)于《中國藥典》中注射用頭孢噻肟鈉含量測定方法的討論[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2010，23（5）：594.

[4]朱建平，高燕霞，梁立革，等.關(guān)于頭孢噻肟鈉測定方法的商榷[J].中國藥事，2005，19(1)：40-41.

[5]于力.抗生素頭孢噻肟鈉的雜質(zhì)研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2004.

[6]Lerner DA，Bonnefond G，F(xiàn)abre H，et al.Photodegradation paths of cefotaxime[J].J Pharm Sci，1988，77（8）：699-703.