HPLC法同時測定附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸的含量

方東偉，彭佳慶（鄂州市食品藥品檢驗檢測中心，湖北鄂州 436000）

附子理中丸（濃縮丸）是由附子（制）、黨參、白術（炒）、干姜、甘草五味中藥制成的濃縮丸劑，具有溫中健脾的功效，可用于脾胃虛寒、脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫等的治療[1-4]。該制劑收載于我國《衛生部頒藥品標準·中藥成方制劑》（第7冊）[5]，該標準中無含量測定項，且目前尚未有同時測定附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸含量的報道。鑒于此，筆者參考相關文獻[6-9]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定該制劑中甘草苷和甘草酸含量的方法，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型HPLC儀，包括SIL-20A自動進樣器、SPD-M20A檢測器、LC-Solution工作站（日本Shimadzu公司）；LC-350A型超聲波處理器（濟寧市魯超儀器有限公司）；BS21S型、BS210S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）

1.2 藥品與試劑

附子理中丸（濃縮丸）（河南宛西制藥股份有限公司，批號：140601；蘭州佛慈溪制藥股份有限公司，批號：14M39；蘭州太寶制藥有限公司，批號：81150110；蕪湖張恒春藥業有限公司，批號：1505111；馬鞍山天福康藥業有限公司，批號：201410022；陜西天洋制藥有限責任公司，批號：20140304；規格：每8丸相當于原生藥3 g）；甘草苷對照品（批號：111610-201005，純度：94.9%）、甘草酸銨對照品（批號：110731-201116，純度：93.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～35 min，19%→50%A；35～36 min，50%→100%A；36～40 min，100%→19%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：237 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取甘草苷對照品4.84 mg，甘草酸銨對照品7.18 mg（甘草酸質量＝甘草酸銨的質量/1.020 7，即約為7.03 mg），置于同一50 mL量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品粉末0.5 g，置于25 mL量瓶中，加70%乙醇溶液適量，超聲（功率：250 W，頻率：33 kHz，下同）處理30 min，冷卻至室溫，加70%乙醇溶液定容，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數以甘草苷峰計≥5 000，保留時間為14.7 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、2、3、4、6、8 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇溶液定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以甘草苷和甘草酸質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得甘草苷回歸方程為y＝16 475x－73 589（r＝0.999 1）、甘草酸回歸方程為y＝3 107.9x－19 221（r＝0.999 2）。結果表明，甘草苷和甘草酸檢測質量濃度線性范圍分別為9.68～96.8、14.08～140.8μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，甘草苷和甘草酸的LOQ分別為0.2、0.3μg/mL，LOD分別為0.1、0.01μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.85%、1.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：140601）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.21%、0.22%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：140601）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，甘草苷和甘草酸含量的平均值分別為2.65、6.80 mg/g，RSD分別為0.94%、0.39%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取樣品（批號：140601）適量，共9份，每份約0.2 g，分別置于10 mL量瓶中，各加入低、中、高質量的甘草苷和甘草酸對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1Results of recovery tests（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取6批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者曾考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相時的色譜情況，結果以甲醇-水、乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，甘草苷、甘草酸峰與干擾峰不能有效分離，而采用乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，洗脫時間適宜，各峰分離較好。因此，本試驗選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相。

3.2 超聲提取時間的選擇

筆者考察了超聲處理時間（10、20、30、40 min）對樣品提取率的影響。結果，隨著超聲處理時間的延長，樣品的提取率增加，但是超聲處理30 min和40 min時的樣品提取率基本一致，為節約試驗時間，本試驗選擇超聲處理時間為30 min。

綜上所述，本方法操作簡便、結果準確，可用于附子理中丸（濃縮丸）中甘草苷和甘草酸含量的同時測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部：[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：1013-1014.

[2]謝亞晶，席珊珊.HPLC法測定附子理中丸（水蜜丸）含量[J].黑龍江科技信息，2016，14（5）：8.

[3]姜秀晶，賈誠，李錦.附子理中丸中甘草酸含量的HPLC測定[J].現代中藥研究與實踐，2011，25（2）：66-68.

[4]鐘碧華，陸帥.HPLC法測定附子理中丸中烏頭堿的含量[J].海峽藥學，2014，26（11）：115-117.

[5]衛生部藥典委員會.衛生部頒藥品標準：WS3-B-1350-93[S].1992.

[6]杜蓉，張孟佑.HPLC法測定加味逍遙丸中芍藥苷與甘草苷的含量[J].中國藥房，2015，26（18）：2571-2572.

[7]傅勇，李旭，虞金寶.HPLC法測定紅花逍遙片中芍藥苷及甘草苷含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：152-154.

[8]張俊燕.HPLC法測定固本咳喘片中甘草酸和補骨脂素的含量[J].藥學與臨床研究，2012，20（4）：379-380.

[9]曾英彤，黃志軍，李澤華.HPLC法測定復方甘草片中甘草酸的含量[J].中國藥師，2009，12（11）：1584-1585.?