HPLC法同時測定腰痛膠囊中4種成分的含量Δ

羅春穎，黃曉婧，史立川，蒲旭峰#（.成都中醫藥大學藥學院，成都637；.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 60000）

腰痛膠囊是由補骨脂、赤芍、肉桂等藥材組成的中藥成方制劑，具有補腎活血、強腰止痛的功效，臨床上主要用于治療腎虛腰痛、腰肌勞損等。該制劑收載于國家食品藥品監督管理總局國家藥品標準（標準文號：YBZ06902006-2015Z），但僅以芍藥苷的含量作為其質量控制指標；且現有文獻多為研究測定腰痛片中相關成分含量測定的方法[1-4]，尚未有測定腰痛膠囊中多個成分含量的報道。鑒于此，本課題組參考相關文獻[5-8]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定腰痛膠囊中赤芍的主要成分（芍藥苷）、肉桂的主要成分（桂皮醛）、補骨脂的主要成分（補骨脂素和異補骨脂素）含量的方法，以期為完善該制劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters-2998型HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、Empower pro自動進樣色譜工作站（美國Waters公司）；AE240型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；AE220型電子分析天平（德國Sartorius公司）；SK25OH型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；Milli-Q AdvantageA10型純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

腰痛膠囊（長春海外制藥集團有限公司，批號：20160701、20161201、20170302，規格：0.3 g/粒）；芍藥苷對照品（批號：110736-201539，純度：96.4%）、桂皮醛對照品（批號：110710-201619，純度：99.4%）、補骨脂素對照品（批號：110739-201416，純度：99.9%）、異補骨脂素對照品（批號：110738-201614，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 min，10%B；0～15 min，10%→25%B；15～35 min，25%→32%B；35～40 min，32%→90%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：240 nm（芍藥苷、補骨脂素、異補骨脂素）、290 nm（桂皮醛）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品5.22 mg、桂皮醛對照品30.82 mg、補骨脂素對照品6.56 mg、異補骨脂素對照品6.40 mg，加甲醇制成質量濃度分別為0.100 6、0.612 7、0.131 0、0.127 8 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內容物1.2 g，研細，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液適量，超聲（功率：250 W，頻率：53 kHz，下同）處理50 min，冷卻至室溫，再加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照品溶液 根據樣品的處方比例和制備工藝，分別制備缺補骨脂、赤芍和肉桂的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數均≥5 000。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量作為線性混合對照品溶液Ⅰ，再取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、0.8、0.6、0.4、1 mL，分別置于1、1、1、1、25 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得線性混合對照品溶液Ⅱ～Ⅵ。取上述線性混合對照品溶液Ⅰ～Ⅵ適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限（LOD）與檢測限（LOQ）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD，結果見表2。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、桂皮醛、補骨脂素、異補骨脂素峰面積的RSD分別為1.40%、0.20%、0.50%、0.40%（n＝6），表明儀器精密度良好。

表2LOQ與LOD測定結果（ng）Tab 2 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20160701）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，芍藥苷、桂皮醛、補骨脂素、異補骨脂素峰面積的RSD分別為0.80%、0.99%、0.39%、0.43%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20160701）內容物粉末約1.2 g，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，芍藥苷、桂皮醛、補骨脂素、異補骨脂素含量的平均值分別為2.678 0、0.470 8、0.223 0、0.216 0 mg/g，RSD分別為1.06%、1.37%、0.79%、1.14%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20160701）約0.6 g，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 3Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本課題組采用二極管陣列檢測器在200～400 nm波長范圍內對混合對照品溶液進行光譜掃描，發現芍藥苷在232 nm波長處、補骨脂素與異補骨脂素在246 nm波長處、桂皮醛在290 nm波長處具有強吸收。綜合考慮，芍藥苷、補骨脂素和異補骨脂素在240 nm波長處均有較大吸收，因此最終確定本試驗的檢測波長分別為240 nm（芍藥苷、補骨脂素和異補骨脂素）、290 nm（桂皮醛）。

3.2 提取溶劑的考察

本課題組考察了甲醇、50%甲醇溶液、乙醇、50%乙醇溶液對待測成分提取率的影響。結果發現，50%甲醇溶液作為提取溶劑時，芍藥苷、桂皮醛、補骨脂素、異補骨脂素的總含量最大，因此選擇50%甲醇溶液為本試驗的提取溶劑。

3.3 提取方法及時間的考察

本試驗比較了回流法和超聲法對待測成分提取率的影響，結果上述兩種方法待測成分的提取率無明顯差異，綜合考慮超聲法操作簡便，因此選擇超聲法為本試驗的提取方法；進一步考察超聲處理時間（30、40、50、60 min），結果發現超聲處理50 min時待測成分的含量最高，因此最終確定本試驗的超聲處理時間為50 min。

3.4 流動相及洗脫方式的考察

筆者考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87，V/V）3種流動相系統在等度洗脫與梯度洗脫條件下對本試驗色譜的影響[4，9-15]。結果發現，甲醇-水和乙腈-0.1%磷酸溶液（13∶87，V/V）作為流動相在等度和梯度洗脫條件下，芍藥苷及桂皮醛色譜峰峰形較差；以乙腈-水為流動相梯度洗脫時，各色譜峰的分離度和峰型均良好且保留時間最為理想，因此確定本試驗的流動相為乙腈-水，洗脫方式為梯度洗脫。

綜上所述，本方法操作簡單、結果準確，適用于腰痛膠囊中芍藥苷、桂皮醛、補骨脂素、異補骨脂素含量的同時測定。

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