馬克斯克魯維酵母菌的分離鑒定與所產乳糖酶酶學性能研究

岳壽松　邊斐　張燕　孫蕊蕊　齊自成　李福欣 　朱友峰

摘要：為研究開發具有應用價值的新型微生物資源，用鄰硝基苯酚β-D-半乳糖苷 （ONPG ） 法，從雪蓮菌發酵乳中分離到一株產乳糖酶的酵母菌株XL-B36，通過分子鑒定，確定該菌為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。對該菌所產乳糖酶酶學性能進行研究，該酶最適反應溫度和最適pH值分別為47℃和7.0，在35 ～ 40℃具有良好的穩定性。pH 5.0 ～ 8.0表現穩定，pH 7.0 時出現酶活峰值。金屬離子Mn2+、Mg2+、Na+對酶活具有激活作用，Ca2+和Zn2+對酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對酶活具有完全抑制作用。

關鍵詞：馬克斯克魯維酵母；β-半乳糖苷酶；分子鑒定；酶學性質

中圖分類號：S182 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0066-06

Abstract In order to research and develop new microbial resources with applied value， a novel lactase-producing yeast XL-B36 was selected from fermented milk by ONPG method and identified as Kluyveromyces marxianus by molecular identification. The enzymatic properties of lactase produced by it were studied and the results showed that the temperature and pH value of β-galactosidase were 47℃ and 7.0， respectively. The enzyme was stable at pH 5.0～8.0，and 35～40℃. The activity of β-galactosidase was promoted by Mn2+，Mg2+ and Na+，but inhibited by Ca2+ and Zn2+. It could be completely inhibited by Cu2+ and ethylene diamine tetraacetic acid （EDTA）.

Keywords Kluyveromyces marxianus； β-galactosidase； Molecular identification； Enzymatic properties

乳糖酶即β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，又名β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），是一類催化β-D-半乳糖苷鍵發生水解的酶，能將乳糖水解成半乳糖和葡萄糖，對解決人體存在的乳糖不耐受具有重要意義[1]。不同種類微生物所產乳糖酶性能不同，霉菌產生的乳糖酶最適pH偏酸性，可應用于酸性乳清和奶酪的水解；而酵母菌和細菌所產乳糖酶最適pH 近中性，適于牛乳和鮮乳清的水解[2-4]。隨著對傳統發酵乳制品研究的深入，越來越多的酵母菌種、屬在各種乳制品中被檢出，包括開菲爾酸奶、蒙古酸馬奶、蘇丹發酵乳Rob、匈牙利發酵乳等[5-8]。王遠微等[9]從西部牧區10份傳統發酵牦牛酸奶樣品中鑒定出16株馬克斯克魯維酵母菌。謝婕等[10]從傳統發酵牦牛酸乳中鑒定得到馬克斯克魯維酵母17株（47.2%）、釀酒酵母6株（16.7%）、平常假絲酵母5株（13.9%）、喜仙人掌畢赤酵母4株（11.1%）、發酵畢赤酵母3株（8.3%）。馬克斯克魯維酵母具有減少食品中乳糖含量的作用，可通過發酵分解乳糖，產生多種羰基化合物和揮發性脂肪酸，這些芳香物質也是形成乳制品獨特風味的主要原因之一[10]。本試驗從特色雪蓮菌發酵乳中分離到一株產乳糖酶的酵母菌株，利用18S rDNA技術對菌株進行分子鑒定，研究酵母菌乳糖酶的特性，為挖掘利用自然界特殊功能微生物資源和開發利用乳糖酶提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

市售雪蓮菌牦牛酸奶；酵母基因組DNA提取試劑盒，購自Solarbio公司；通用引物EF3 （5′-TCCTCAAATGACCAAGTTTG-3′）和EF4 （5′-GGAAGGGRTGTATTTATTAG -3′）及ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′）和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′），由上海生物工程有限公司合成；PCR buffer、Taq酶、dNTP，購自寶生物（大連）生物工程有限公司。

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖糖苷（X-gal，色譜純），鄰硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷 （ONPG，色譜純），購自Bio Basic Inc公司（上海生物工程有限公司分裝）；鄰硝基苯酚 （ONP），購自國藥集團化學試劑有限公司。

ONPG磷酸鹽緩沖液制備：0.602 5 g ONPG溶于100 mL磷酸鹽緩沖溶液；pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液制備：13.6 g磷酸二氫鈉、0.06 g硫酸鎂、0.126 g氯化錳溶于1 L水；檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液制備：0.1 mol/L檸檬酸與0.2 mol/L磷酸氫二鈉混合；0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液制備：0.2 mol/L的醋酸和0.3 mol/L的醋酸鈉混合后稀釋一倍；0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液制備：0.2 mol/L的甘氨酸和0.2 mol/L的氫氧化鈉混合。PDA培養基制備：去皮馬鈴薯200 g加蒸餾水1 000 mL，煮沸20 ～ 30 min，2層紗布過濾，棄濾渣。葡萄糖20 g、瓊脂20 g、補充蒸餾水至1 000 mL，自然pH。種子培養基（g/L）制備：乳糖20 g、酵母膏3.5 g、蛋白胨3.5 g、 pH 6.0。發酵培養液制備：乳糖80 g/L，葡萄糖5 g/L，酵母膏7 g/L，尿素1.5 g/L，KH2PO4 15 g/L，MgSO4 1 g/L，MnCl2 0.1 g/L，pH 6.6 ～ 6.8。

冷凍高速離心機 （美國Thermo Fisher公司）；PCR儀 （日本Takara公司）；UP200s型超聲波破碎儀 （德國Dr. Hielscher公司）；TSQ-280型立式搖床 （上海精宏實驗設備有限公司）；723型可見分光光度計 （上海光譜儀器有限公司）。

1.2 酵母菌分離與產乳糖酶篩選

將1 mL雪蓮菌牦牛酸奶加入盛有9 mL無菌生理鹽水的試管中，渦旋器振蕩混勻，制成10-1稀釋液，依次進行梯度稀釋。選取10-4、10-5、10-6稀釋液100 μL分別涂布PDA平板，30℃培養48～72 h，對長出疑似酵母菌的菌落（乳白或灰乳白色）顯微鏡觀察細胞形態，劃線純化至單菌落，4℃斜面保存。

乳糖酶X-gal初篩：將24 mg X-gal溶解于6 mL二甲基甲酰胺（DMF），配制成終濃度為4 mg/mL 的溶液，取該溶液200 μL涂布PDA平板，待表面干燥后，劃線接種上述挑選出來的菌株。30℃培養48～72 h，菌落變為藍色的為產乳糖酶菌株。

1.3 β-D-半乳糖苷酶活性測定

1.3.1 標準曲線繪制 取6支試管分別加入200 μg/mL的ONP溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，磷酸鹽緩沖液補足至1 mL，37℃水浴10 min。分別加入0.5 mol/L Na2CO3 4 mL。以第一只試管為空白，測OD420值。以ONP濃度（mmol/L）為縱坐標，OD420值為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 酶的發酵與提取 挑取斜面菌種，接入裝有50 mL種子培養基的三角瓶 （250 mL）中，28℃、100 r/min旋轉振蕩培養20 h。按質量分數為3%的接種量將種子液接入發酵培養液中，28℃、150 r/min旋轉振蕩培養18 h。取4.0 mL發酵液，7 000 r/min離心5 min，傾去上清液，菌體用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液 （pH 7.0） 洗滌，7 000 r/min離心 5 min，重復洗滌兩次。加入濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液（ pH 7.0，含濃度為0.5 mmol/L MgSO4，濃度為0.1 mmol/L MnCl2） 至4.0 mL懸浮菌體，置冰水浴中超聲波破碎。振幅30%，間歇破胞15 min，4℃、10 000 r/min離心5 min ，取上清液測酶活。

1.3.3 酶活性測定 取1 mL酶稀釋液，37℃水浴預熱5 min，加入已預熱至37℃含20 mmol/L ONPG磷酸鹽緩沖液1.0 mL，37℃水浴反應10 min，立即加入0.5 mol/L Na2CO3 3 mL終止反應，測OD420值。以65℃加熱失活的酶液作為空白對照。一個酶活力單位（U）定義為：37℃條件下，水解1 min產生1 μmol ONP 所需要的酶量。X= （C×20×N）/10。其中，X為乳糖酶活力；C為標準曲線上對應的ONP濃度；N為稀釋倍數。

1.4 18S rDNA基因的克隆、測序

采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取DNA，利用通用引物EF3、EF4 和ITS1、ITS4分別擴增酵母菌18S rDNA 和ITS序列。PCR反應體系 （20 μL）：超純水13.4 μL，10 × PCR buffer 2 μL，dNTP 0.3 μL，引物各1 μL，Taq酶0.3 μL，DNA 2 μL。PCR擴增條件為：①94℃ 5 min；94℃ 45 s，51℃ 1 min，72℃ 2 min，30個循環；72℃ 10 min。② 95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 1 min，72℃ 1 min ，30個循環；72℃ 10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，交由華大基因（武漢）中心測序。

1.5 系統發育樹構建

在NCBI網站對測得的18S rDNA 和ITS分別進行序列間的BLAST分析或通過DNAMAN 6.0進行序列相似性分析。利用Mega 3.1軟件中的Kimura雙參數模型計算各序列間距離，采用鄰位相連法（Neighbor-joining，NJ）構建系統進化樹。

1.6 β-D-半乳糖苷酶酶學性能

1.6.1 最適反應溫度與熱穩定性 最適反應溫度：取9份200 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）稀釋的酶液分別于30、35、37、40、45、47、50、55、57℃保溫5 min，同時將9份200 μL ONPG溶液分別在上述溫度下保溫5 min后加入到酶液中，在各溫度下反應10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL終止反應。計算各溫度酶活與最高酶活百分比，確定酶最適反應溫度。

酶的熱穩定性：將200 μL磷酸鹽緩沖液稀釋的酶液，分別于35、40、45、50、55℃保溫0、20、40、60、80 min。同時將200 μL ONPG溶液分別在上述溫度下保溫 0、20、40、60、80 min，將ONPG加入到粗酶液中，37℃反應10 min，加入0.5 mol/L Na2CO3 600 μL終止反應，測OD420值，以65℃加熱失活的酶液作為空白對照，以保溫開始時酶活為100%，計算各時間酶活與最高酶活百分比。

1.6.2 最適pH值和pH穩定性 最適pH值：分別配制pH 2.0～10.0的緩沖液 （pH 2.0～3.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 4.0～5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液、pH 6.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH 9.0～10.0的0.05 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），在最適溫度下，按1.3.3酶活測定方法，測定pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0條件下酶活性。計算各pH酶活與最高酶活百分比，確定酶最適反應pH值。

pH穩定性：將酶液分別置于pH為3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0的緩沖溶液中，37℃保溫60 min后置冰上，然后將pH值調回至7.0，測定各pH條件下的酶活，以最高酶活為100%，計算各pH酶活與最高酶活百分比，測定酶的pH穩定性。

1.6.3 金屬離子和EDTA對酶活的影響 在酶促反應體系中加入1 mol/L的Mn2+、Mg2+、Na2+、K2+、Ca2+、Cu2+ 、Zn2+、EDTA溶液，使最終反應體系中金屬離子濃度為1 mmol/L。以加熱失活的酶液作為空白對照，不加金屬離子和EDTA溶液的酶活作為對照，計算相對酶活。

2 結果與分析

2.1 酵母菌產乳糖酶能力篩選與菌種鑒定

利用PDA平板進行酵母菌分離培養，對培養出的酵母菌利用X-gal培養基進行產乳糖酶能力篩選，得到一株產酶能力強的酵母菌株XL-B36，菌體在PDA培養基呈圓形或橢圓形，菌體直徑2.8～5.0 μm，芽殖。

測序結果表明，XL-B36菌株18S rDNA序列全長1 690 bp，符合預期值。BLAST顯示與大多數克魯維酵母屬（Kluyveromyces）聚成一族，同源性為99%。系統發育分析顯示與鑒定為馬克斯克魯維酵母聚為一族，因此鑒定XL-B36菌株為馬克斯克魯維酵母（圖1）。

2.2 ONPG標準曲線

以光密度OD420值為橫坐標，ONP 濃度為縱坐標繪制乳糖酶活標準曲線，相關系數R2=0.998（圖2），說明該標準曲線可用于乳糖酶的測定。

2.3 XL-B36乳糖酶最適反應溫度與熱穩定性

在30～47℃范圍內，乳糖酶活性隨溫度升高而增加，47℃條件下活性最高，之后隨溫度升高活性快速下降，55℃降至最高酶活的34.3%，至57℃已檢測不到酶活（圖3）。因此乳糖酶的最適反應溫度為47℃。

乳糖酶活性在35℃和40℃具有較好的穩定性，保溫80 min，相對酶活仍保持60%以上。45℃穩定性下降，50℃穩定性快速下降，處理20 min降至最高酶活的50%以下（48.6%），40 min酶活僅為最高酶活的31.1%。說明該酶對熱敏感（圖4）。

2.4 XL-B36乳糖酶最適pH與pH穩定性

測定酶在pH 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的活性變化，以最高酶活為100%計算不同pH條件下的相對酶活。結果表明乳糖酶酶活在pH 5 ～ 10范圍內為單峰曲線變化，最適pH為7.0（圖5）。pH 4.0時檢測不到酶活性，在5.0 ～ 8.0 范圍內比較穩定（圖6）。

2.5 金屬離子和EDTA對乳糖酶活性的影響

Mn2+、Mg2+、Na+對酶活有明顯的激活作用，Ca2+和Zn2+對酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對乳糖酶活具有完全抑制作用（表1）。

3 討論與結論

酵母菌是目前工業化生產乳糖酶的主要菌種資源。本研究從傳統雪蓮菌發酵乳中分離到一株產乳糖酶的酵母菌，克隆該菌的18S rDNA序列，序列全長1 690 bp，BLAST顯示該菌株在進化關系上與克魯維酵母屬聚成一族，鑒定為馬克斯克魯維酵母 （XL-B36）。XL-B36乳糖酶最適反應溫度為47℃，之后隨溫度升高乳糖酶活性快速下降，至57℃已檢測不到酶活；該酶在35～40℃有較強的穩定性，高于45℃穩定性快速下降。XL-B36乳糖酶最適pH為7.0，在5.0～8.0范圍內比較穩定。金屬離子Mn2+、Mg2+、Na+對酶活有明顯的激活作用，Ca2+和Zn2+對酶活具有抑制作用，Cu2+和EDTA對乳糖酶活性具有完全抑制作用。

金屬離子對酶活具有調節作用，謝毅等[12]的研究表明，高濃度金屬離子對乳酸克魯維酵母乳糖酶活性具有抑制作用，Ca2+對酶的抑制可以被磷酸鹽、脫脂乳以及Mg2+、Mn2+所恢復。母智森[13]研究發現分離自乳制品的馬克斯克魯維酵母STK-1-1所產乳糖酶最適pH為6.5，酶的最適作用溫度范圍為35～45℃，Cu2+、Ca2+對酶的活力有抑制作用，K+、Na+、Mg2+對酶有激活作用。XL-B36與STK-1-1所產的乳糖酶相比，最適pH略有不同（6.5和7.0），最適溫度范圍和金屬離子對酶活的影響基本相同。李文婷等[2]研究了凝結芽孢桿菌RY237 β-半乳糖苷酶酶學性能，其最適反應溫度和最適pH值分別為50℃和6.0，金屬離子Ca2+、K+、Zn2+、Mn2+、Na+、Mg2+對酶活具有抑制作用，Cu2+對酶活具有完全抑制作用，而EDTA對酶活具有激活作用。李淑娟[14]研究發現，黑曲霉乳糖酶DL116酶促反應最適溫度為60℃，最適pH 3.2～4.0，該酶在pH 2.5～9.0范圍較穩定，在pH 7.5～9.0處理2 d仍保持最大酶活的94%以上，表明該酶具有很好的耐堿性。不同種類微生物產乳糖酶性能有很大差異，是乳糖酶開發應用的重要理論依據。本研究馬克斯克魯維酵母乳糖酶最適pH值為7.0，最適作用溫度范圍為35～45℃，適宜商業化應用。后續將研究乳糖酶代謝調控機制。

參 考 文 獻：

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