PCR技術在豬肉中微生物檢測的應用分析

□ 鞏長海 江蘇權正檢驗檢測有限公司

食品安全關系著人們的身體健康、社會經濟的有序發展以及社會的和諧穩定，保障食品安全是全社會、全人類的共同責任。食品安全中最主要面臨的問題為食源性疾病，即通過攝食進入人體的有害物質引發的一類疾病，包括食物中毒、腸道感染、寄生蟲病以及有害的化學物質引發的疾病。

我國每年消費大量的豬肉，作為居民副食品，豬肉的消費占肉類總消費比重的50%以上。但最近幾年，關于豬肉安全問題的事件層出不窮，近十幾年來，豬肉安全問題事件高達700多起，50%以上的食品安全事件是由違規使用瘦肉精、二噁英等化學品引發的，還有一部分來源于物理性風險。全世界每年有70%的食源性疾病患者是由致病微生物引起的。因此，微生物是引發是源性疾病的根源，在豬肉進入市場之前，就有必要對其進行致病微生物檢測，從而減少食品安全問題事件的發生。

目前，檢測豬肉中微生物的主要技術有PCR技術、DNA探針法、基因芯片等。傳統的檢測技術存在檢測效率低而成本高的弊端，使用受到了限制。PCR技術因高特異性、高靈敏性和簡便快捷等優點成為其中一種最常用的檢測方法。

1 PCR微生物檢測技術的原理

PCR技術主要是由變性、退火、延伸3個熱循環步驟構成，即在95℃高溫下，DNA雙鏈受熱變性為兩條DNA單鏈，在37～55 ℃的低溫下，兩條寡核苷酸引物與DNA單鏈結合，形成部分雙鏈，然后以單核苷酸為原料，沿DNA鏈從5’端向3’端延伸，合成DNA新鏈。這樣，每個雙鏈的DNA模板經過變性、退火、延伸3個步驟的熱循環之后，形成了兩條雙鏈DNA分子，如此循環往復。

2 PCR技術在食源性微生物檢測中的應用

2.1 PCR技術檢測豬肉中的沙氏菌

沙氏菌占美國食源性疾病的30%，沙氏菌病原體也是引發我國內陸地區食源性疾病的首要病菌。沙氏門菌主要存在于豬肉中，所以對豬肉中的沙氏菌進行快速而有效的檢測可以有效防止沙氏菌引起的食物中毒。研究者王靜等人發現，在脫氧膽酸鈉和疊氮溴化丙錠（PMA）的共同作用下，可以大幅度地抑制沙氏菌死菌DNA的PCR擴增，活菌DNA的擴增不受影響。把疊氮溴化丙錠（PMA）與微滴數字PCR技術相結合，可以針對性地對豬肉中的沙氏菌進行有效檢測。

2.2 PCR技術檢測豬肉中的大腸桿菌

腸出血性大腸桿菌可以引發腸炎和出血性腹瀉，又被稱為大腸埃希氏菌。其中最主要的菌型是大腸桿菌，它是一種新型的腸道致病菌，是全世界公認的人獸致病微生物，主要寄生在豬、牛、羊等動物中。國內研究者針對大腸桿菌的菌體抗原基因、鞭毛抗原基因、溶血素基因、緊密黏附素基因和和志賀祥毒素基因的序列，設計了6對特異性的引物和探針，快速、特異性的檢測大腸桿菌。

2.3 PCR技術檢測豬肉中金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌可以引發動物和人體的化膿感染，產生的腸毒素可以造成食物中毒，腸毒素具有極高的熱穩定性，在幾百攝氏度的高溫下也不會失活，所以，即使感染的食物經過高溫烹煮仍然存在致病的風險。經過市場檢測，生豬肉中金黃色葡萄球菌的檢出率接近20%，應引起食品監管部門的高度重視。國內研究者李苗云等人把金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因作為靶基因，再與BP平板計數法相結合，在20℃條件下PCR熒光測定生豬肉中的金黃色葡萄球菌。實驗結果顯示，在穩定期之后傳統平板計數法低于熒光測定。

2.4 PCR技術檢測豬肉中的單核李斯特菌

李斯特菌是一種單核細胞增生菌，也是一種易引發人畜共患的食源性病菌。單核細胞增生菌具有嚴重的致病性，可以引發敗血癥、腦膜炎等。該病菌在5℃左右的低溫下仍然可以生長和繁殖，所以大量存在于未殺菌的冷藏食品中。國內研究者李丹丹用iap基因作為靶基因，合成引物和探針，用實時熒光定量的PCR快速檢測方法，靈敏度為6.5CFU/mL。國外研究者采用了RT-PCR法檢測低溫冷凍的豬肉中的單核李斯特菌，省掉了預富集的步驟，與其他幾十種菌株沒有擴增信號，而且特異性良好。

3 結語

目前，PCR技術在食源性致病微生物、轉基因成分以及動物源成分檢測中得到了非常廣泛地應用。該技術一旦被推廣使用，將會大大縮短檢測時間，提高檢測效率，食品檢測水平也隨之提高。但是，PCR技術也存在一定的缺陷：如果致病微生物發生高度變異，會使檢測結果出現假陽性；用于生成標準曲線的樣品不同，結果沒有參考價值。PCR技術可以對豬肉中的微生物進行定量檢測，還可以應用拓展到更多的食品安全領域。