微生態制劑活菌數方法研究進展

王畢英，王洪麗，劉彥民

（內蒙古雙奇藥業股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010010）

微生態制劑源自于微生態學原理學，其具有保護或調節微生態平衡的功能，通過對宿主產生益生菌或者通過促進有益物質生成而制備成的制劑，主要起到預防、調節和治療疾病的作用。平板菌落計數法是將待測樣品經過適當稀釋，將稀釋后的樣品在一定條件下進行培養，培養后得到的樣品中所含菌落的數量，在一般情況下認為將一個肉眼直觀可以看見的菌落代表一個單細胞。選擇一個合適的稀釋度并乘以相應的稀釋倍數就可以比較準確地獲得樣品中微生物的具體數量。平板菌落計數法以其具有良好的重復性，并可以相對準確地體現樣品中活菌數量的優點，成為了如今我國衛生標準規定所認定可行的方法，并且在食品藥品研究領域得到了廣泛的應用。

1 微生物活菌計數方法分析

1.1比濁法

在進行微生物液體培養時，活菌的增加導致培養液渾濁度的增加，該方法能夠簡單、快速、直觀地觀察活菌的生長趨勢并且可以運用分光光度計測定其含量，但在測定時未能判斷微生物的死活，所以該測定方法不太準確。

1.2 含氮量測定法

大多數微生物的含氮量比例較一致，根據含氮量再乘以一定的數值即可測得其粗蛋白的含量，從而大致可以得到活菌的生長情況，傳統方法常用凱氏定氮法進行測定，該方法具有廣泛的適應性、操作簡單易行、試劑消耗少等優點，但是其只能測得有機氮的含量，所以其測定結果不太準確。

1.3 血球計數板法

此法是在顯微鏡下直接進行測定，方便快捷并且儀器損耗較小，但在一定的容積中微生物的個體數目包括死活細胞均被計算在內，還有微小雜物也被計算在內，這樣得出結果往往偏高，因此適用于對形態個體較大的菌體計數。

1.4 液體稀釋法

對活菌進行連續的10倍系列稀釋，經過培養后，記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然后查MPN表（最大可能數表），再根據樣品的稀釋倍數就可計算其中的活菌含量，該方法可較準確計算活菌數，但操作過程比較繁瑣。

1.5 平板菌落計數法

取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養基，經培養后由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞；統計菌落數，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出樣品中的含菌數，但其操作繁瑣，需要培養一定時間才能獲得，而且測定結果受多種試驗因素（如培養溫度、培養時間、培養基等）的影響，但是該方法能夠相對準確地獲得活菌數量的信息，所以被廣泛應用。

2 影響微生物活菌數的因素

2.1 培養基對活菌的影響

不同培養基中所含的成分與含量都不盡相同，例如最簡單的基礎培養基，其主要成分就是牛肉浸液和蛋白胨，其主要功能是用于細菌的增菌、檢驗；再在此基礎上會有營養培養基，可加入葡萄糖、血液、生長因子等特殊成分，供營養要求較高的細菌和需要特殊生長因子的細菌生長，所添加的成分不同，對活菌的影響就會不同；除此之外，鑒別培養基在培養基中加入抑制劑，去抑制標本中的雜菌生長，有助于對所選擇的細菌種類的生長，主要用于區分目標菌，不同培養基的用途不同，其中不論是碳源或是氮源的含量均會對活菌數形成產生影響。

嚴佩峰等人[1]研究脫脂乳、脫脂乳酶解液和MRS 3種基礎培養基對乳酸菌進行發酵培養，得到脫脂乳酶解液是保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合菌種較好的基礎培養基，保加利亞乳桿菌在該培養基進行培養時活菌數最高。張紅艷等人[2]研究發現對碳源和氮源是影響地衣芽孢桿菌活菌數的主要因素，其中玉米粉對地衣芽孢桿菌的活菌數影響最大。

2.2 培養時間對活菌的影響

根據活菌生長繁殖速率的不同，可將生長曲線大致分為遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期，所以活菌在不同時間之下進行培養都會對活菌的數量造成影響，其中，細菌在對數期生長迅速，活菌數以恒定的幾何級數增長，生長曲線圖上細菌數的對數呈直線上升，達到頂峰狀態，期間細菌的形態、染色性、生物活性等都較典型，對外界環境因素的作用敏感，所以常會選取對數期的活菌作為研究對象進行試驗。

高業成[3]將嗜酸乳桿菌采用傾注的接種方式于36℃分別在24，48，72 h進行培養，結果得到嗜酸乳桿菌在培養到72 h時，可以更加容易觀察菌斑，所以嗜酸乳桿菌的最佳觀測期為72 h。閆亞梅[4]研究發現在選用保加利亞乳桿菌進行驗證時，當將其培養至48 h時，活菌數最高且容易觀察。

2.3 培養溫度對活菌的影響

溫度是通過影響微生物膜的液晶結構、酶和蛋白質的合成與活性，以及RNA的結構和轉錄等影響微生物的生命活動，具體表現在2個方面：一方面，隨著微生物所處環境溫度升高，微生物細胞中的蛋白質和酶活性增強，生物化學反應加快，生長速率提高；另一方面，隨溫度上升，微生物細胞中對溫度較敏感的組成成分（如蛋白質、核酸等）會受到不可逆的破壞。超過最適溫度以后，生長速率隨溫度升高而迅速下降。

易文芝[5]對益生菌發酵技術進行研究，發現菌株在37℃進行培養時，可以得到較高活菌數。張巖等人[6]研究發現乳酸乳桿菌在4℃的條件下進行保存可以得到最佳活菌數，對延長乳酸乳桿菌活力提供了有力的支持。李志成等人[7]研究發現不同發酵溫度下所制得的凍干發酵劑活菌數均有很大不同，其中于30℃條件下進行發酵所制得的凍干發酵劑的活菌數最高。

2.4 接種方式對活菌的影響

常見的微生物接種方法有平板涂布法與液體傾倒法，平板涂布法不僅可以用于計算活菌數，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學因素對微生物的抑殺效應，其可以計數，可以觀察菌落特征，還可以進行菌種的分離，但接種前需梯度稀釋，吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延；液體傾倒法相較平板涂布法簡單，將液體迅速直接傾注于平皿，防止污染即可。

曾理等人[8]研究發現在采用平板涂布法測定乳酸菌活菌數時，該法操作較為簡便，且經培養后發現乳酸菌的生長狀況良好，同時能夠更加容易觀察到乳酸菌的菌斑狀態，對乳酸菌的活菌計數非常適合。高業成[3]通過對嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌分別進行平板涂布法和液體傾倒法進行培養，結果顯示以上2種方法對活菌數的影響并沒有顯著差異。

2.5 微生物發酵工藝優化對活菌的影響

不同發酵工藝會對活菌的活力產生影響，在不同發酵條件下所得到的活菌存活率均有所不同，如果想要得到最高活菌數，必須控制其發酵條件，其中對發酵溫度與發酵時間的控制尤為重要。

陳慶彩等人[9]研究發現以鼠李糖乳桿菌和瑞士乳桿菌二者進行共培養和發酵，在初始酸堿度值6.8，接種量6%，發酵溫度37℃，鼠李糖乳桿菌與瑞士乳桿菌的接種比例2∶1，除此之外，瑞士乳桿菌提前接種3 h，在這個條件下，得到乳酸菌的活菌數最高。吳楠等人[10]研究發現影響德氏乳桿菌活菌數的主要因素是發酵溫度、發酵時間與接種量，其中發酵時間為最重要的影響因素。

2.6 其他因素對活菌的影響

除了以上所論述的一些常規影響條件外，還有其他因素，如水分含量、其他添加物質等會對活菌數產生影響。

劉秀清等人[11]研究發現不同益生元對鼠李糖乳桿菌的生長發酵產生影響，其中低聚異麥芽糖對鼠李糖乳桿菌的生長促進作用效果最佳。郭羽等人[12]研究發現黃芪多糖對鼠李糖乳桿菌的生長具有促進的作用，除此之外，還可以改善鼠李糖乳桿菌的穩定性。鮑志寧等人[13]研究水分對干酪乳桿菌的影響，發現在添加了保護劑聚葡萄糖的時候會使活菌變得更加穩定，對活菌數的影響不大。楊郁等人[14]研究發現，低聚糖對植物乳桿菌的影響較大，相較葡萄糖而言，可以運用低聚糖對其進行發酵。

3 結語

活菌數作為一種能夠考查微生態制劑安全性的質量控制指標，提高微生態制劑的活菌數能夠極大地保持制劑的穩定性，發酵溫度與發酵時間作為影響活菌數的重要因素，通過試驗優化得到其最適發酵溫度與發酵時間，對活菌數的提高有益處。另一方面，平板活菌計數法也可應用于檢測微生態制劑類的活菌數量，活菌數作為能夠指示微生態制劑品質好壞與保存時間長短的最直觀指標，一直以來都是研究的熱點。