分離沙門氏菌的注意事項

曾金金，趙瑋

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局技術中心，山東 濰坊 261041；2.山東益生畜禽疾病研究院，山東 煙臺 265508)

沙門氏菌是一種嚴重危害人和動物的致病菌，對種雞危害巨大。其能定居于機體內多個內臟器官，通過生殖系統和糞便能夠垂直傳播和水平傳播。產蛋種雞感染沙門氏菌后引起死淘增加，飼料轉換率降低，生產性能下降，種蛋孵化水平下降；雛雞感染沙門氏菌后，死淘增加，嚴重影響產品質量。因此，在實驗室進行沙門氏菌的分離鑒定工作對生產現場具有非常重要的指導意義。本文就沙門氏菌的分離鑒定時的注意事項進行總結如下。

1 樣品采集

1.1 病死雞的病料采集 病死雞一般取其肝臟、脾臟、卵巢、腸道；新生雛雞取其肝臟、卵黃，樣品采集要求無菌操作。

1.2 環境采樣

1.2.1 水樣的采集 采集點為養殖場的水源、雞舍水線（包括前端、后端），先將出水點周圍消毒，再用滅菌瓶接取水樣以免環境中的細菌進入樣品中影響結果。

1.2.2 飼料的采集 不同點采集飼料，采樣總量為100g混勻，隨機采樣2份。

1.2.3 墊料或糞便、灰塵采樣 對于平養場區，在雞舍內不同區域采取墊料、雞糞，在雞舍的前中后至少均勻取5個點，每個點取樣至少10g，混勻，不同雞舍或不同欄總采集5份，或者采樣時采樣者穿著一次性鞋套在雞舍內走三圈，然后把鞋套底朝內翻轉裝入封口袋待檢，不同雞舍或欄采集樣本5份。籠養場雞舍內用同一棉簽蘸取多點，要求10點以上，采集樣本10份裝入封口袋待檢。

2 樣品的保存及運輸

樣品采集后若不能及時檢測，要放入4℃保存，樣品在運輸過程中要保證溫度。夏天避免溫度過高導致腐敗，冬天避免結冰。

3 增菌液的選擇

培養沙門氏菌的前增菌液有蛋白胨緩沖水、胰酶解酪蛋白大豆肉湯培養基，選擇性肉湯培養基有亞硒酸鹽胱氨酸肉湯（SC）、氯化鎂孔雀綠、液體連四硫酸鹽等。由于前增菌液對沙門氏菌的選擇性不高，所以實際分離過程中可以將沙門氏菌選擇性肉湯作為增菌液進行增菌，不同來源的樣品所攜帶的細菌種類不同，因此分離沙門氏菌時就要選擇不同的增菌液。由于硒對人體有毒性作用，所以SC現在使用較少。

3.1 病死雞病料的沙門氏菌分離。由于病死雞病料中所攜帶細菌種類較少，對增菌液的選擇性不高，SC、氯化鎂孔雀綠、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）、液體連四硫酸鹽都可以對其進行增菌，也可以取其肝臟、脾臟、卵巢直接劃線接種于鑒別培養基進行分離培養。

3.2 肛拭子、糞便（包括雛雞胎糞）、腸內容物、墊料、灰塵進行沙門氏菌分離時一般選擇液體連四硫酸鹽增菌液進行增菌，效果較好。

3.3 水、飼料、種蛋可以選擇SC、氯化鎂孔雀綠、液體連四硫酸鹽進行增菌。

4 鑒別培養基的選擇

樣品增菌24h后，要劃線接種于鑒別培養基，沙門氏菌的鑒別培養基有SS瓊脂、木糖賴氨萜醇-4培養基（XLT4）、膽硫乳瓊脂培養基（DHL）、麥康凱、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、亮綠（BG）、沙門氏菌顯色培養基等等，沙門氏菌在不同培養基上生長的菌落形態以及顏色不同，不同培養基對其他雜菌的抑制作用也不一樣，肝臟、脾臟、卵巢可以選擇普通營養瓊脂、SS、XLT4、膽硫乳瓊脂培養基（DHL）、麥康凱、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂(XLD)、煌綠、沙門氏菌顯色培養基等，肛拭子、糞便（包括雛雞胎糞）、腸內容物、墊料、灰塵增菌24h后選擇普通營養瓊脂、SS、XLT4、沙門氏菌顯色培養基效果較好。沙門氏菌顯色培養基在選擇性培養基中的效果要好于其他鑒別培養，但是價格較高，XLT4能有效抑制其他競爭微生物的生長，特別是變形桿菌的生長，所以在分離環境樣品中占有很大的優勢。由于不同或同一細菌在不同鑒別培養基上的生長形態都不同，所以傳代于鑒別培養基時要選擇多種培養基以便于快速得到可疑菌落。沙門氏菌在不同培養基上的菌落形態為：普通營養瓊脂上為無色半透明、邊緣整齊的圓形菌落；SS平板上沙門氏菌呈圓形、表面光滑、濕潤、中心黑色（有些菌株無黑色中心）、邊緣透明的菌落；DHL與SS平板上沙門氏菌菌落相似但黑色中心比SS平板上所形成的大一些；XLT4平板上沙門氏菌呈粉紅色、中間帶有金屬光澤的黑色中心、邊緣整齊的圓形菌落；XLD與XLT4平板上的沙門氏菌菌落相同；BG平板上沙門氏菌為紅色、邊緣整齊的圓形菌落；麥康凱上沙門氏菌為無色、中心略帶粉色、邊緣整齊的圓形菌落。

5 生化鑒定

生化鑒定要選擇沙門氏菌鑒定生化管，操作時要確保所檢測菌落為純化后的單一菌株。

6 單因子血清凝集

對分離的可疑菌落先進行A-F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙形菌株，不能分型。被A-F多價 O 血清凝 集 者 ，依次用 O1、O2、O4、O5、O9、O12因子血清做凝集試驗根據試驗結果，判定O群。每一個O抗原成分的最后確定均應根據O單因子血清的檢查結果，沒有O單因子血清的要用兩個O復合因子血清進行核對。不被A-F多價O血清凝集者，先用9種多價O血清檢查，如有其中一種血清凝集，則用這種血清所包括的O群血清逐一檢查，以確定O群。屬于A-F各O群的常見菌型，H因子血清檢查第1相和第2相的H抗原。不常見的菌型，先用8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝集，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以第1相和第2相的H抗原。每一個H抗原成分的最后確定均應根據H單因子血清的檢查結果，沒有H單因子血清的要用兩個H復合因子血清進行核對，檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查，如仍只檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相單相菌不必做位相變異檢查。單因子血清凝集法能快速準確的對沙門氏菌分型。

7 傳統檢測方法（國標法）與PCR法

傳統的分離方法最終可得到沙門氏菌的純培養物，方法簡單、準確、可重復性強，有一定的靈敏性，但檢驗程序復雜，耗時較長，一般4～7d。PCR靈敏性高、特異性好、操作簡單，出結果較快，但易出現假陽性，操作時首先要確保引物設計質量，如果選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列，靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性，需要重新設計引物。熱裂解法提取DNA簡單、快捷較為常用，細菌DNA降解與煮沸時間存在一定的正相關性，獲得PCR的量于煮沸時間成正相關，在獲得同樣PCR效果的前提下，煮沸時間越短越好，以2min為宜。

以上闡述了沙門氏菌分離幾個環節所需的注意事項，但不能面面俱到，在實驗室操作過程中每一步都要求規范、仔細的操作，以得出準確的實驗結果。