microRNAs： 支氣管哮喘的潛在新靶點

賀琳娟，劉姬艷

作者單位：310036 杭州師范大學生命與環境科學學院

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是以持續的氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的慢性呼吸道疾病，有多種細胞及細胞組分的參與，包括嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T 淋巴細胞及肥大細胞等炎癥細胞，氣道上皮細胞、平滑肌細胞等氣道結構細胞和 IL-4、IL-9、IL-13、FOXP3 轉錄因子、TNF-α 等細胞組分[1]。哮喘臨床出現反復發作的呼吸道癥狀，如反復的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等[2]。據統計，全球3 億人患有哮喘，每年有 25 萬人死于該病。發達國家如澳大利亞、英國、加拿大的哮喘患病率高達 10% 以上[2]，我國的哮喘患者也逐年增加，尤其是兒童哮喘患者，已經從2000 年的 1.97% 增加到了 2010 年的 3.01%[3]。

由于哮喘病因和發病機制的復雜性，給患者的準確診斷和有效治療帶來了困難，目前哮喘的診斷主要依據喘息的病史、發作的臨床表現以及結合肺功能測定，但由于間隙性喘息和咳嗽也發生在非哮喘的其他呼吸系統疾病，而肺功能測定需要患者配合，不適合低齡兒童，因而對哮喘的準確診斷造成困難[4]。哮喘的治療一般以藥物控制為主，如吸入糖皮質激素（ICS）、β2-受體激動劑、白三烯調節劑等，但長期口服激素會誘發骨質疏松、糖尿病、肥胖癥等不良后果，白三烯調節劑只能部分預防運動誘發的支氣管痙攣[5]，故哮喘的診斷治療還需要尋找有效的新靶點。

microRNA（miRNA），是一類長 18 ～ 25 個核苷酸的內源性非編碼 RNA 分子，在各物種間具有高度的進化保守性、基因表達時序性和組織特異性等特點[3,6]。miRNA 的作用機制包括三種，兩種是經典的調控方式：靶 miRNA 的5'UTR 與靶 mRNA 的 3'UTR 完全互補配對時，靶 mRNA被 RNA 誘導沉默復合物（RISC）特異性降解；靶 miRNA的 5'UTR 與靶 mRNA 的 3'UTR 不完全互補配對時，抑制靶 mRNA 的翻譯，但不影響 mRNA 的穩定性[7-8]。另一種是 2017 年新發現的調控方式：miRNA 指導其靶向mRNA 快速脫腺苷化，導致 mRNA 的快速衰減和表達水平的降低[9-10]。研究發現，miRNA 在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發揮著重要的調控作用，并且與某些疾病的發生、發展存在著密切的聯系，如腫瘤、肺結核、肺血栓、心血管疾病等[3,11-12]。本文就 miRNA 在哮喘樹突狀細胞、T 淋巴細胞中的作用，在哮喘氣道炎癥和氣道重塑中扮演的角色以及哮喘治療方面的研究作一綜述。

1 miRNA 指導哮喘樹突狀細胞的分化

樹突狀細胞（DC）是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。肺部的 DC 細胞可以通過誘導調節性 T 細胞或 T 輔助細胞 Th1 來阻止對吸入無害性抗原的免疫應答，而 DC 細胞的功能和免疫性受到 miRNA 的嚴密調控[13-15]。

成熟的 DC 細胞能有效地激活初始型 T 細胞，在初始T 細胞分化的調節中起關鍵作用，同時誘導 Th1/Th2 型免疫應答的偏移[14]。脂多糖（LPS）誘導的 DC 細胞成熟可表現為 CD80 和 CD86 表達增強，Zhang 等[16]研究表明，let-7i 在 LPS 誘導的 DC 細胞成熟過程中上調，而 let-7i的下調明顯阻礙 DC 細胞成熟，CD80 和 CD86 表達降低。Zech 等[17]研究表明，miR-155 在卵白蛋白或房塵螨誘導的 DC 細胞中表達上調，其缺陷直接影響過敏性氣道炎癥中 DC 細胞的成熟，CD80、CD83 和 CD86 的表達減少。

2 miRNA 指導哮喘 T 淋巴細胞的分化

T 淋巴細胞是哮喘調控的中樞效應細胞，哮喘的氣道炎性與抗原特異性 Th2 細胞的形成有重要作用，而 miRNA可調節 T 細胞增殖、存活、活化、分化和細胞因子的產生[18]。

Zhou 等[15]提出，miR-155 能通過三大途徑來調節 Th2炎癥：一是通過預防 DC 細胞的抗原遞呈；二是抑制 Th2細胞的分化；三是下調 Th2 細胞分泌 IL-4、IL-5 和 IL-13。Baumjohann 和 Ansel[18]研究發現，miR-155 缺陷型 T 細胞能產生更多的 IL-4、IL-5 和 IL-13 以及較少的干擾素 γ（IFN-γ），而 IL-4 特異性的轉錄因子 c-Maf 的表達增加可使 miR-155 缺陷型 T 細胞向著 Th2 細胞分化。Banerjee 等[19]發現，IFN-γ 對 CD4+T 細胞分化具有多效性作用，在 CD4+T 細胞活化后，IFN-γ 信號通過轉錄激活因子 1（STAT1）誘導 Th1 分化的關鍵轉錄因子 T-bet 的產生。T-bet 可以增強 Th1 細胞分化，抑制 Th2 細胞分化[20]。當 miR-155 過表達時，CD4+T 細胞向 Th1 分化，而抑制miR-155 的表達則可使 CD4+T 細胞向 Th2 分化。Lu 和Rothenberg[21]發現，IL-12 p35 的 3'UTR 含有高度進化保守的 miR-21 的靶序列，miR-21 的缺失會增加 IL-12 和IFN-γ 的表達；IL-12 是參與適應性免疫應答中 Th1 極化的關鍵分子，miR-21 可通過調節 IL-12 p35 的表達來調節Th1/Th2 的平衡，miR-21 缺陷的 CD4+T 細胞可向 Th1 分化。另有研究發現，體外 T 細胞中 miR-21 的過度表達促進了 Th2 細胞的分化，而在活化的 CD4+T 細胞中，miR-27 或 miR-128 的過表達則降低了 IL-4 和 IL-5 的分泌，促進了 Th1 細胞分化[22]。在過敏原刺激的 miR-155 KO 小鼠的氣道中 Th17 和 Treg 細胞顯著減少，表明miR-155 在體外調節 Th17 細胞和調節性 T 淋巴細胞Treg 的分化[23]。

3 miRNA 在哮喘氣道炎癥中的作用

哮喘作為具有遺傳易感性的慢性氣道炎癥性疾病，近年來越來越多的證據表明，miRNA 參與哮喘氣道炎癥調節。

免疫學上認為哮喘的發生與 Th1/Th2 比例失衡相關，這種比例失衡導致多種炎性因子釋放，最終引起哮喘氣道炎癥[24]。Rijavec 等[25]使用微陣列分析輕度、重度哮喘患者和非哮喘患者支氣管活檢樣品中 let-7a、miR-21 和 miR-223三種 miRNA 的表達，結果顯示三種 miRNA 在哮喘中差異表達，let-7a 在嚴重哮喘患者中下調，miR-223 在人類哮喘 T 細胞中下調；差異表達的 miRNAs 在氣道炎癥、Th1/Th2 極化和嗜酸性粒細胞的發育中發揮重要作用，還直接或間接地抑制一些關鍵因子的轉錄，如信號轉導與轉錄激活因子 3（STAT3）、白細胞介素、IFN-γ、轉化生長因子 β受體（TGF-β receptor）、Toll 樣受體 4（TLR4）和血管內皮生長因子（VEGF）等。Simpson 等[26]研究表明，miR-17～ 92 簇（miR-17、miR-18、miR-19 和 miR-92），特別是miR-19a 可通過同時靶向 NF-κB、JAK-STAT 和 PI(3)K 途徑的抑制劑來促進 Th2 細胞因子的產生，哮喘氣道 T 細胞內 miR-19a 上調，增加了 IL-13 的產生，從而促進體內Th2 驅動的細胞炎癥。Martinez-Nunez 等[27]的實驗結果表明，miR-18a、miR-27a、miR-128 和 miR-155 在哮喘患者氣道上皮細胞炎癥中發揮作用，發現在支氣管上皮細胞中miR-18a、miR-27a、miR-128 和 miR-155 同時下調可顯著增加 IL-6 和 IL-8 的 mRNA 水平。

Th2 氣道炎癥不僅表現為炎性細胞浸潤，還伴隨著支氣管肺泡灌洗液中 Th2 細胞因子如 IL-4、IL-5 和 IL-13的增加[28]。Malmh?ll 等[23]研究表明，Th2 細胞通過分泌Th2 細胞因子在變應性哮喘的發病機制中起關鍵作用，其中 miR-155 參與調節氣道中過敏原誘導的 Th2 介導的嗜酸性粒細胞炎癥。他們發現，miR-155 KO 小鼠嗜酸性粒細胞水平降低，黏液分泌增加，同時 Th2 細胞和細胞因子IL-4、IL-5、IL-13 減少，表現出 Th2 活化受損，表明miR-155 KO 小鼠中過敏性氣道炎癥減少是由于 Th2 細胞應答缺陷造成的。

4 miRNA 在哮喘氣道重塑中的作用

在持續氣道炎癥中，由炎癥細胞和氣道平滑肌細胞產生的細胞因子和趨化因子使氣道平滑肌增生，進而導致氣道結構改變稱為氣道重塑[29-30]，氣道重塑是哮喘的另一個主要特征。Dileepan 等[30]研究發現，在人體氣道平滑肌細胞中，miR-708 和 miR-140-3p 對 TNF-α 刺激引起的炎癥反應具有抗炎作用，也就是與 IL-17 促炎途徑相關的一些組分被下調，而與細胞周期相關的一些基因上調，最終導致平滑肌細胞增生；miR-708 在抑制哮喘相關趨化因子 CD44 和CD38 的 mRNA 表達的同時還下調哮喘相關基因如ADAM33 和 RARRES2 的表達，miR-140-3p 則對趨化因子 CXCL12 基因具有顯著抑制作用。

Ras 同源基因家族成員 A（RhoA）可介導細胞外調節蛋白激酶的磷酸化，促進嗜酸粒細胞的趨化，促進氣道平滑肌細胞的增殖。IL-13 是支氣管氣道內一種主要的細胞因子，與支氣管平滑肌的收縮有關，它能夠通過轉錄激活因子6（STAT6）依賴機制增加 RhoA 的 mRNA，同時通過STAT6 獨立下調 miR-133a 來增加 RhoA 的翻譯，從而誘導 RhoA 蛋白上調。Chiba 和 Misawa[31]研究發現在哮喘支氣管平滑肌細胞中 miR-133a 的下調會導致 RhoA 的上調，致使平滑肌細胞增殖；而當 IL-13 刺激支氣管平滑肌細胞時，RhoA 的升高也伴隨著 miR-133a 的下調，導致平滑肌收縮。

此外，過敏原誘導的炎癥與哮喘患者氣道重塑反應相關，Th2 細胞因子 IL-4 和 IL-13 在氣道重塑中發揮重要作用。IL-13 對變應原誘導的哮喘患者具有直接的纖維化和氣道重塑作用，并且能夠調節噬酸細胞活化趨化因子和骨膜蛋白的產生。骨膜蛋白是一種細胞外基質蛋白，若在氣道上皮細胞中表達增加，可通過基底膜增厚，上皮下纖維化和嗜酸性粒細胞炎癥而導致氣道重塑[23]。另有研究發現，IL-22能夠作用于上皮細胞和氣道平滑肌細胞，促進氣道平滑肌的增生[32]。現有研究發現，miR-155 缺陷的小鼠不僅出現免疫受損，還表現出了與哮喘相似的氣道重塑，在哮喘小鼠中miR-155 的表達下降，使 IL-13 表達上升，從而促進骨膜蛋白的產生[33]。

5 miRNA 在哮喘治療中的潛在價值

目前在臨床上治療哮喘主要采用糖皮質激素和 β-2 受體激動劑。糖皮質激素和 β-2 受體激動劑可以通過控制氣道炎癥和舒張氣道平滑肌改善患者的癥狀，但是副作用明顯，如發音困難、骨質疏松、肥胖癥、鵝口瘡和心律失常等，還有一些患者對糖皮質激素不敏感[5]。此外，利用細胞或者細胞因子的單克隆抗體或拮抗劑等治療哮喘也取得了很大進展。但是單克隆抗體較高的治療費用嚴重制約了其在臨床上的應用，且自體疫苗能否在體內有效產生抗體也是一個問題，其技術并未成熟[34]。

miRNA 在哮喘中具有潛在的治療作用，可通過反義抑制或過表達 miRNA 來治療哮喘。在 miRNA 過表達引起的疾病中，可用反義抑制法，反義抑制 miRNA 包括使用鎖核苷酸修飾的反義寡聚核苷酸和膽固醇分子偶聯的寡聚核苷酸結合 miRNA 使其失活。在 miRNA 表達下調所引起的疾病中，可使用 miRNA 類似物或成熟的 miRNAs 進行替代治療[9]。

近年來，利用 miRNA 進行疾病治療的研究逐漸增多。首個 miRNA 靶向藥物——抗 miRNA-122 寡聚核苷酸已作為抗丙型肝炎病毒的藥物進入臨床試驗[2]。有研究指出，選擇性封閉 miR-126 可以抑制哮喘表型，使 Th2 反應、炎性反應、氣道高反應、嗜酸粒細胞聚集和黏液分泌均減弱[6]。越來越多的 miRNA 被發現與哮喘疾病發展有關，從而使其成為最有潛力的治療手段，且基于 miRNA 的治療藥物已進入臨床試驗期。

6 小結

雖然 miRNA 在哮喘發病機制以及治療的研究仍舊處于起步階段，但是目前已經發現一些 miRNA 在哮喘中被上調或者下調，這些 miRNA 可能有助于我們預測哮喘發病的靶點，也可以成為哮喘治療的新方法。但是利用miRNA 治療哮喘也有一定的危險性，盡管 miRNA 本身并沒有毒性，但是其傳遞介質等可能引起其他作用，比如免疫反應的激活及不可預測的細胞分化等。因此還需更加深入地了解 miRNA 的功能，為利用 miRNA 治療哮喘奠定基礎。