葡萄酒中高分子聚合多酚的研究進展

索昊，田若晨，張舒婷，孫寶山*

（1. 沈陽藥科大學藥學院，遼寧沈陽 110016；2. 沈陽藥科大學中藥學院，遼寧沈陽 110016；3. 沈陽藥科大學功能食品與葡萄酒學院，遼寧沈陽 110016）

多酚類物質(zhì)是葡萄酒的重要的組成成分，由于其不僅對葡萄酒的感官特性有著決定性的作用，更是影響葡萄酒生物活性的重要化合物，因此近些年來引起了科學界的廣泛關注。研究表明，葡萄酒中高分子聚合多酚是葡萄酒多酚的主要存在形式，由于其分子量大并且結(jié)構復雜，難以進行分析，因此對其研究報道并不多見，已有研究報道多集中于葡萄酒多酚中的小分子酚類物質(zhì)、聚合原花青素與聚合色素。近些年來，隨著科學技術的發(fā)展，對高分子聚合多酚的研究取得了一定的進展，因此高分子聚合多酚的結(jié)構分析及生物活性研究逐漸成為了葡萄酒研究者的工作重點。本文綜述了國內(nèi)外關于葡萄酒中高分子聚合多酚的形成過程、含量測定、結(jié)構組成、生理活性等研究報道，為高分子聚合多酚今后的研究提供參考。

1 高分子聚合多酚的含量及形成

葡萄多酚包括原花青素類（單倍體、低聚體、高聚體）、花色苷類、酚酸、白藜蘆醇及其衍生物、黃酮醇、黃烷醇及黃酮類化合物。葡萄酒多酚不僅包括來自葡萄本身的多酚類物質(zhì)，而且也包括一些在釀酒過程中形成的新型酚類化合物，并且在釀酒的初期階段，某些酚類化合物的酶促或非酶促反應開始發(fā)生，這一反應過程在葡萄酒的發(fā)酵和陳釀過程中會持續(xù)存在，這些化學反應使葡萄酒多酚的結(jié)構組成更加復雜，形成了結(jié)構多樣的高分子聚合多酚。紅酒中高分子聚合多酚主要由高聚原花青素、花色苷-原花青素聚合物（直接縮合，間接縮合）、聚合色素，小分子酚酸等各類物質(zhì)組成[1-3]。高聚原花青素是高分子聚合多酚的一部分，其本身的聚合程度高，可以由幾十個單倍體聚合而成，由于花色苷也可以與原花青素聚合，這更增加了高分子聚合多酚的聚合程度，同時也增加了高分子聚合多酚的分子量。

以酒齡一年的葡萄牙產(chǎn)的干紅葡萄酒為例，從定量分析的角度看，兒茶素類化合物約占多酚總量的5%～8%，原花青素二聚體占5%～10%，花色苷類占10%～15%，酚酸類成分占3%～6%，黃酮醇類成分的含量少于1%，白藜蘆醇一直是人們關注的熱點，其含量僅占多酚的0.3%左右，然而高分子聚合多酚的含量高達80%左右。這一研究結(jié)果表明，高分子聚合多酚是葡萄酒多酚最主要的存在形式[4]。

2 高分子聚合多酚的分離與結(jié)構分析

孫寶山等[5]在1994年首次采用C18固相萃取小柱，實現(xiàn)了葡萄酒中高分子聚合多酚的提取分離。2006年，孫寶山等[6]采用“組合分段法”，根據(jù)物質(zhì)極性大小，以甲醇為洗脫劑，獲得高分子聚合多酚組分，并成功的將原花青素（寡聚、多聚）從聚合色素物質(zhì)中分離出來，并對各組分的化學結(jié)構進行了初步分析驗證。2013年，Wollmann等[7]采用超濾法也從紅葡萄酒中分離得到了分子量大于5 kDa的高分子聚合多酚。

化學降解法是一種常見的分析前處理技術手段，其目的在于將大分子化合物降解為小分子化合物，通過對小分子化合物的結(jié)構分析，進而推測大分子的結(jié)構組成。以化學降解法分析多聚原花青素的結(jié)構為例，目前的降解方法主要有酸催化降解、金屬催化降解、堿催化降解、微生物降解[8-11]。酸催化降解反應是比較簡單常用的方法。在酸和親核試劑同時存在的條件下，原花青素的黃烷-3-醇結(jié)構單元之間的連接鍵斷裂，釋放末端的結(jié)構單元，同時單元中C4位形成的碳正離子被適當?shù)挠H核試劑進攻，形成親核附加衍生物。孫寶山等[12]采用芐硫醇作為親核試劑降解原花青素，此方法可應用于原花青素平均聚合度的檢測。張舒婷等[13]用無色無味的間苯三酚代替芐硫醇作為親核試劑對原花青素進行降解，更加安全，有更廣泛的應用。Torres等[14-15]以巰基乙胺為降解試劑，對白葡萄皮渣中的聚合原花青素進行降解，得到新型半胱胺-黃烷醇結(jié)合物，經(jīng)研究表明這些降解結(jié)合產(chǎn)物具有保護神經(jīng)細胞的功能。羅蘭馨等[16]使用亞硫酸將葡萄籽和葡萄皮中的聚合原花青素降解成為寡聚以及單倍體原花青素。崔璨等[17]利用卡托普利為降解試劑在酸催化的條件下，以葡萄籽粗提物為對象，分析了葡萄籽提取物中高聚原花青素的組成，并發(fā)現(xiàn)卡托普利-黃烷醇的結(jié)合物可作為潛在的抗高血壓的前藥。Jiang等[18]采用Pd／C為催化劑氫化降解興安落葉松中的原花青素，降解率可達到為67.5%。White等[19]報道在堿性水解條件下解聚蔓越莓果渣中的高聚原花青素，短時間內(nèi)，隨著溫度的增高，降解成低分子量的原花青素產(chǎn)率增加，但降解后的低聚原花青素成分復雜，難以分離得到。微生物降解原花青素是一個復雜的過程，王恒永等[20]在真菌降解沙棘原花青素的研究中，篩選出了可對沙棘原花青素進行降解的菌種，結(jié)果表明該菌對原花青素有一定的降解效果。

由于高分子聚合多酚的結(jié)構復雜，因此將樣品直接注射入HPLC或者ESI-MS很難將其分離檢測。在之前的研究中，對紅酒多酚進行“分段”處理，在酸性條件下，采用芐硫醇為降解試劑，對酒齡一年的干紅葡萄酒中的高分子聚合物多酚進行化學降解，對降解產(chǎn)物進行分析檢測，并計算其平均聚合度[6]。并且，聚合程度不同的原花青素，以及花色苷-原花青素縮合產(chǎn)物（直接、間接）也成功的被檢測到存在于高分子聚合多酚中[21]。

2013年，Wollmann等[7]采用了HPLC-MS/MS、MALDITOF MS、HPLC-UV/Vis和Ion Chromatography對高分子聚合多酚的結(jié)構特征進行分析，結(jié)果表明，高分子聚合多酚的結(jié)構骨架是由原花青素類的物質(zhì)構成的，(-)-兒茶素、(+)-表兒茶素、(-)-表兒茶素沒食子酸酯被檢測到作為終端和延展單元，(-)-表沒食子兒茶素僅作為延展單元?；ù渌仄咸烟擒?、花青素葡萄糖苷、甲花翠素葡萄糖苷、甲基花青素葡萄糖苷、二甲花翠素葡萄糖苷這5種常見的花色苷被檢測到作為終端單元存在于高分子聚合多酚中。小分子酚酸、氨基酸也同時被檢測到。乙醛作為葡萄酒中酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，在其存在的條件下，原花青素類化合物可通過1,1-乙烯橋鍵互相連接縮合，該反應發(fā)生原花青素類化合物的A環(huán)上，同時，花色苷和吡喃花色苷也會通過C-C鍵與原花青素類物質(zhì)連接縮合。

3 高分子聚合多酚的生物活性研究

近幾十年來，針對紅酒多酚生物活性研究有大量的研究報道。其主要研究對象為原花青素單倍體[22-23]、二聚體與三聚體[24]、白藜蘆醇及其衍生物[25]、黃酮及黃酮醇[26]、酚酸[27]及花色苷類化合物[28-29]。然而，目前國內(nèi)外關于葡萄酒高分子聚合多酚的研究報道較少，且僅集中在高聚原花青素。

關于紅酒多酚的體外活性研究，Sun等采用DPPH法對紅酒中多酚類物質(zhì)（低聚體原花青素、高聚體原花青素、花色苷及其衍生物混合體、聚合色素）以及兒茶素、表兒茶素、槲皮素、二甲花翠素葡萄糖苷這4種酚類化合物標準對照品進行了相關研究。結(jié)果表明，這些紅酒多酚類物質(zhì)具有較強的清除自由基的能力，具有體外抗氧化活性，首次為紅酒中多聚原花青素的體外抗氧化活性提供了直接證據(jù)[30]。

關于聚合多酚體內(nèi)活性研究報道較少，Déprez等[31]研究表明，高聚原花青素被人結(jié)腸微生物群降解成為小分子酚酸，首次證明飲食攝入的聚合多酚類化合物在體內(nèi)可被降解成小分子化合物，根據(jù)代謝產(chǎn)物的類型，直接證明了原花青素具有相應的營養(yǎng)價值。2009年，Kimura等[32]通過對小鼠進行口服脂肪耐量試驗，結(jié)果表明從日本七葉木中提取得到的高聚原花青素，具有抑制脂肪消化的功能，證明了聚合多酚可以作為營養(yǎng)劑使用，具有潛在的抗肥胖功能。最近，Masumoto等[33]的研究表明，蘋果中的聚合多酚會影響腸道微生物菌群的代謝，從而對代謝平衡產(chǎn)生有益的影響。

4 高分子聚合多酚的研究展望

針對目前高分子聚合多酚的研究，還存在著許多的不足之處，筆者認為主要有以下3個方面：首先，研究者們獲取得到的葡萄酒中高分子聚合多酚為混合粗提物，其中不僅有高分子聚合多酚存在，單體花色苷及低聚原花青素類物質(zhì)也存在于其中，從而造成對高分子聚合多酚的分析及活性研究顯得并不那么準確。因此，尋找一種有效的方法來獲得并大量制備出純化的高分子聚合多酚組分是必要的。另外，高分子聚合多酚結(jié)構復雜，還有大量的結(jié)構組成沒有被揭示，因此選擇合適的降解方法、降解條件及檢測方法來分析鑒定降解后的單體碎片，從而繼續(xù)揭示高分子的結(jié)構組成特征是必要的。最后，不同葡萄品種，以及是否經(jīng)過橡木桶的陳釀對葡萄酒產(chǎn)生重要影響的因素是否會改變高分子聚合多酚的結(jié)構組成，也是我們應該關注的焦點。