自噬在腎小管上皮細胞損傷中的研究進展

袁芳+郭鵬威+尤燕舞

【關鍵詞】自噬；腎小管上皮細胞；信號通路

中圖分類號：R692.9 文獻標識碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.06.025

自噬（autophagy）是細胞依賴溶酶體途徑，是高度保守地對胞內蛋白和部分細胞器（如線粒體、內質網）進行降解的過程，對維持細胞增殖、分化，穩定細胞內環境及促進異常細胞凋亡有重要作用。研究發現，腎缺血-再灌注（Ischemic reperfusion，I/R）損傷、膿毒癥腎損傷、腎間質炎癥、纖維化和慢性腎臟病等腎小管間質疾病的發病機制與凋亡有不同程度的關系，而自噬與凋亡在某些方面有一定關系，由此，自噬在腎小管上皮細胞（tubular epithelial cells，TECs）損傷中很可能有重要作用。然而，導致這些損傷的機制尚不明確。筆者從分子生物學角度就自噬的分類、形成、信號通路調控的研究進展進行綜述。

1自噬的概念及分類

自噬是存在于高等動物細胞中的普遍生命現象[1]，是真核細胞在缺氧、炎癥等環境壓力條件下，依賴溶酶體途徑對胞內損傷或衰老的蛋白質及細胞器進行降解的代謝過程，對維持細胞內環境穩態有重要作用。過去普遍認為自噬是一個非選擇性的過程，而目前研究發現自噬是一個可被誘導和精準選擇的過程[2]。

自噬是一種程序化的胞內降解過程。20世紀60年代，它首次被描述為本體降解系統，通過溶酶體途徑滅活水溶性大分子（如核酸、蛋白質、碳水化合物、脂類）和衰老的細胞器（如線粒體、核糖體、過氧化物酶體、內質網）[3]，得以滿足細胞代謝、細胞器更新和細胞內環境穩態的需要。正常生理環境下，自噬能夠清除細胞內“雜物”，維持細胞的正常生理功能；應激（如饑餓、缺氧、缺血、氧化應激）條件下，自噬活動增強，導致大量蛋白質及細胞器被過度自我消化，引起細胞結構和功能的不可逆損害。

根據進入溶酶體的途徑，自噬過程可分為三種主要類型：（1）巨自噬 （macroautophagy）：來自非溶酶體途徑的雙層膜結構將胞內可溶性蛋白質和變性壞死的細胞器包裹，形成吞噬泡，逐步擴大形成自噬體，最后運送至溶酶體繼而被降解。此過程中的雙層膜可能形成于線粒體膜[4]、高爾基體膜[5]或內質網膜[6]。進一步研究發現，部分細胞器存在特異性自噬現象，比如發生在線粒體的線粒體自噬（mitophagy）、發生在核糖體的核糖體自噬（ribophagy）、發生在內質網的內質網自噬（reticulophagy）、發生在過氧化物酶體的過氧化物酶體自噬（pexophagy）、發生在部分脂類的脂類自噬（lipophagy）[7]。（2）微自噬（microautophagy）：溶酶體膜直接內陷，將待降解蛋白質及細胞器包裹然后將其降解。（3）分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy）：蛋白水解系統選擇性地將底物蛋白靶向轉運到溶酶體，溶酶體內腔在兩側的膜和易位專用蛋白的協助下完成特定蛋白質的降解[8]。其中，巨自噬是最常見也是最重要的一種，一般所說的自噬通常是指巨自噬。

2細胞自噬相關基因及分子組成

根據分子遺傳學，自噬的形成過程和發展受多種自噬相關基因（autophagy associated gene，Atg）的調控。Atg發現于20世紀90年代，其參與調節細胞自噬的信號通路的解剖提高了我們對溶酶體降解途徑發生和發展的認識[9]。其編碼的多種蛋白對自噬體的形成和成熟有重要作用[10]。Atg從酵母菌進化到人類具有高度保守性，酵母Atg只有一種，而人類有很多亞群（Atg1，Atg4，Atg8和Atg18等），這些亞群的功能還有待研究。

Atg系統在自噬過程中有重要作用。它有兩個類泛素樣蛋白質及其連接系統-Atg12與LC3（酵母同源Atg8蛋白）。前者主要由Atg12-Atg5-Atgl6復合物組成，負責LC3連接系統的激發和定位；后者通常作為自噬體的標記物[11]。泛素樣蛋白Atg12被Atg7（E1樣酶）激活，在Atg10（E2樣酶）協同下轉運至Atg5，最終形成一個Atg12-Atg5接合體，與Atg16以2∶2∶2的形式形成Atg12-Atg5-Atg16復合物，參與自噬體的擴大。另一個連接系統LC3的修飾也需要E1樣酶和E2樣酶的參與。LC3前體由Atg4修飾后形成LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ與其脂質結合位點（PE）結合，被Atg7（E1樣酶）和Atg3（E2樣酶）作用后形成脂溶性的LC3-Ⅱ-PE。LC3-Ⅱ形成后能夠結合在自噬體膜上，因此LC3-Ⅱ常用作自噬形成的標志[12]。Jiang等[13]在單側腎血管被夾閉的小鼠RIR模型中發現再灌注后的48 h內LC3-Ⅱ以及自噬體明顯增加；而應用氯喹等自噬抑制劑的小鼠在經過28 min的缺血及隨后的血流再灌注后，小鼠血清中肌酐和尿素迅速升高。由此表明，自噬在腎缺血-再灌注損傷中有保護作用。

unc-51樣蛋白酶（unc-51 like kinase 1，ULK1）復合物在自噬過程有重要作用。它由ULK1（Atg1同系物）、Atg13、FIP200（Atg17同系物）三種蛋白組成。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）與ULK1復合物相互作用調節自噬的發生。mTORC1通過與ULK1復合物結合，使ULK1、Atg13發生磷酸化，從而抑制細胞自噬。能量不足或AMP向ATP轉化率升高時，mTORC1活性受到抑制，從ULK1復合物分離，ULK1被激活而發生自我磷酸化，磷酸化的ULK1使得Atg13、FIP200磷酸化，從而誘導自噬的發生。反之，能量充足時，mTORC1被氨基酸和生長因子活化，從而抑制細胞自噬，支持細胞生長[14]。自噬體的形成需要磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3-phosphate，PI3P）的參與[15]，并已證實存在于內質網的特定區域，叫做歐米茄小體[6]。研究數據表明，線粒體膜、細胞膜、核膜也是自噬體形成的場所[16]。hvps34是重要的蛋白復合物，包括調節性蛋白激酶p150、hvps15、Beclin-1和在哺乳動物體最新發現的Atg14L（Atg14類似物）。能量不足條件下，Beclin-1被誘導從Beclin-2解離，hvps34被激活而產生PI3P，PI3P聚集Atg蛋白，促進自噬體的形成。hvps形成兩種蛋白復合物：復合物Ⅰ和復合物Ⅱ。前者對自噬有作用，后者與蛋白空泡形成有關。Atg38被定義為復合物Ⅰ的亞單位。在Atg38△細胞，自噬活動明顯減弱且復合物Ⅰ分解為vpsl5-vps34和Atgl4-vps30亞單位。生化分析顯示Atg38通過C末端聚合，形成Atg38聚合物以保持復合物I的完整性；Atg38通過N末端與Atgl4和vps34結合。這表明Atg38聚合物在物理上連接vpsl5-vps34和Atgl4-vps30亞單位，并促進復合物Ⅰ的形成[17]。endprint

3自噬在腎小管上皮細胞損傷的分子機制

TECs損傷及損傷后的反應是最早出現于腎小管間質的病理生理改變，在腎間質炎癥、腎間質纖維化、慢性腎臟病病程的進展中起中心作用。自噬與各種原因導致的TECs損傷有密切關系。而細胞自噬的調節是一個多步驟的錯綜復雜的過程，人們對其尚未完全掌握，目前已知的調控主要有mTOR、Beclin-1、P53三條途徑。

3.1mTOR信號通路 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是磷脂酰肌醇激酶相關蛋白激酶家族的成員。mTOR以兩種不同形式存在：對雷帕霉素敏感的mTORC1和對雷帕霉素不敏感的mTORC2。前者主要在細胞凋亡、細胞生長、能量代謝和細胞自噬中發揮作用[18]；后者主要參與調控細胞骨架蛋白的形成和存活，而有研究表明，mTORC2也間接調節細胞自噬[19]。其中，mTORC1信號通路是多條信號通路的匯合點，是自噬發生過程的“守門員”，也是目前研究最多的信號通路。mTORC1通過與下游信號分子翻譯起始因子4E結合蛋白-1（translation initiation factor 4E -binding protein-1，4EBP1）、核糖體蛋白S6激酶1（ribosomal protein S6 kinase 1，S6K1）作用，啟動并調控自噬相關基因的轉錄和翻譯，參與自噬水平的調節[20]。趙鴻等人[21]在糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）小鼠腎組織中，用免疫印跡檢測到DN小鼠腎組織中mTOR、p-mTOR、p-S6K1均明顯上升，為mTORC1信號通路參與細胞自噬提供新的證據。

mTORC1的上游信號通路包括：（1）AMPK-mTORC1信號通路。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種異源三聚體蛋白質激酶，受到外源信號刺激后被激活，向下游信號通路分子mTOR傳遞信號，通過調控mTOR的活化水平對調節細胞自噬。梁新華等[22]的研究表明D-葡萄糖通過抑制AMPK通路，上調AMPK下游的mTOR通路，而促進人腎小管上皮細胞（HK-2）的上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）作用。（2）PI3K/AKT/mTOR信號通路。生理條件下，PI3K被激活后產生第二信使分子PI3P，PI3P在磷脂酰肌醇脂依賴性蛋白激酶1協助下使AKT磷酸化，磷酸化的AKT抑制結節硬化TSC1/2復合物的活化，隨之激活mTOR，后者可以從源頭阻斷自噬的發生。在缺血、缺氧等條件下，AMPK可直接被活化，抑制mTORC1活性并使ULK1磷酸化，進而啟動自噬[14]。在高糖培養的腎小管上皮細胞內發現[23]，線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生明顯增多，大量ROS通過激活TGF-β1/PI3K/AKT信號通路，使mTOR磷酸化水平升高，進而使E-cadherin表達下降，EMT相關蛋白a-SMA表達增加，細胞發生EMT。（3）Ras-MEK-ERK信號通路。它調節自噬的具體機制尚不明確，但有研究表明ERK通過抑制TSC1/TSC2活性調節細胞自噬[24]。另外，有研究表明Ras能通過PI3K/AKT通路調節細胞自噬水平。

3.2Beclin-1信號通路Beclin-1為酵母自噬基因Atg6同源基因。人Beclin-1蛋白由三個結構域構成，分別是：BH3同源結構域（Bcl-2-homology3）、中央螺旋區（CCD）和進化保守區（ECD）[25]，它們在其他因子協同下調節自噬水平。Beclin-1的CCD和ECD結構域能與PI3KC3形成復合物，上調自噬水平[26]；該復合物中還包括Atg14，后者是Beclin-1自噬依賴磷酸化的關鍵，但其具體作用機制尚不清楚[27]。Li等[28]在小鼠梗阻性腎病模型發現，梗阻后7～14 d的自噬體、LC3及Beclin-1顯著增加，腎小管上皮細胞損傷數量明顯增加，程度明顯加重。向鏡芬等[29]在大鼠膿毒血癥造成腎臟損傷模型中，采用Western Blotting檢測到LC3、Beclin-1含量隨著腎臟損傷時間的推移而上升。張雅麗等[30]的實驗發現，在大鼠RIR損傷中腎小管上皮細胞中Beclin-1蛋白表達升高，應用自噬抑制劑氯喹后Beclin-1蛋白表達下降，表明在腎臟缺血損傷過程中細胞自噬被激活。因此，Beclin-1參與并調控自噬水平，其具體作用機制需進一步研究。

3.3P53信號通路P53是一種抑癌基因，被認為是最重要的介導細胞凋亡的基因。研究表明，P53在調控細胞自噬中也有重要作用。P53對細胞自噬水平的影響與其在細胞的定位密切相關[31]。在細胞核中，P53主要通過抑制mTORC1上調細胞自噬水平[32]，還能通過激活損傷相關自噬調節因子（damage-regulated autophagy modulator1，DRAM1），后者可以表達溶酶體蛋白，進而上調自噬水平[33]。另外，P53能激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族，Bcl-2對Beclin-1的抑制作用消失，從而上調自噬水平[34]。關于細胞質中P53的研究表明，被敲除掉P53的癌細胞自噬水平上調，而在胞質中重新轉染P53后其自噬水平下調[35]。表明P53在細胞質中的作用是抑制細胞自噬，其機制是P53與FIP200結合，抑制了ULK1-FIP200-Atg13-Atg101復合物的活化，從而對自噬水平起下調作用。Takahashi等[36]在對順鉑誘導鼠腎小管上皮細胞實驗發現，與對照組相比，近曲小管自噬缺陷小鼠腎功能損害更嚴重，其DNA損傷和P53活化更明顯；P53在腎小管上皮細胞的上述演變中有極其重要的調控作用。由此可見，P53對細胞自噬水平的影響取決于其在細胞的定位，為靶向上調或下調細胞自噬，從而預防和治療腎臟間質疾病提供分子生物學依據。endprint

4展望

細胞自噬是一個多步驟，錯綜復雜的過程，貫穿細胞生長發育全過程。細胞自噬參與腎臟的病理生理過程，與缺血-再灌注腎損傷、腎間質炎癥、纖維化和慢性腎臟病等多種常見腎臟病有著密切關系，近年來備受關注。但其分子調節、信號通路等具體機制十分復雜，至今尚未被全面了解。隨著定位于腎小管上皮細胞內部溶酶體途徑和自噬平衡的進一步研究，我們有望通過抑制或激活細胞自噬通路，或通過基因修飾等手段在腎臟間質疾病的預防和治療、改善預后方面取得重大突破。

參考文獻

[1] Tuteja R.Emerging functions of helicases in regulation of stress survival in malaria parasite plasmodium falciparum and their comparison with human host[J].Parasitol Int，2016，65（6 Pt A）：645-664.

[2] Leventhal JS，He JC，Ross MJ，et al.Autophagy and immune response in kidneys [J].Semin Nephrol，2014.34（1）： 53-61.

[3] Mei Y，Thompson MD，Cohen RA，et al.Autophagy and oxidative stress in cardiovascular diseases [J].Biochim Biophys Acta，2015，1852（2）：243-251.

[4] Boudoures AL，Saben J，Drury A，et al.Obesity-exposed oocytes accumulate and transmit damaged mitochondria due to an inability to activate mitophagy [J].Dev Biol.2017，426（1）：126-138.

[5] Wang J，Davis S，Menon S，et al.Ypt1/Rab1 regulates Hrr25/CK1delta kinase activity in ER-Golgi traffic and macroautophagy[J].J Cell Biol，2015，210（2）：273-285.

[6] Deegan S，Saveljeva S，Gorman AM，et al.Stress-induced self-cannibalism：on the regulation of autophagy by endoplasmic reticulum stress[J].Cell Mol Life Sci，2013，70（14）：2425-2441.

[7] Ward C，Martinez-Lopez N，Otten EG，et al.Autophagy，lipophagy and lysosomal lipid storage disorders[J].Biochim Biophys Acta，2016，1861（4）：269-284.

[8] Cuervo AM，Wong E.Chaperone-mediated autophagy：roles in disease and aging[J].Cell Res，2014，24（1）：92-104 .

[9] Jiang P，Mizushima N.Autophagy and human diseases[J].Cell Res，2014，24（1）：69-79.

[10] Kaizuka T，Mizushima N.Atg13 is essential for autophagy and cardiac development in mice[J].Mol Cell Biol，2016，36（4）：585-595.

[11] 趙云，張奉春.細胞自噬與風濕免疫病[J].中華風濕病學雜志，2016，20（3）：197-200.

[12] Hong JM，Kim SJ，Lee SM，et al.Role of necroptosis in autophagy signaling during hepatic ischemia and reperfusion[J].Toxicol Appl Pharmacol，2016，308：1-10.

[13] Jiang M，Liu K，Luo J，et al.Autophagy is a renoprotective mechanism during in vitro hypoxia and in vivo ischemia-reperfusion injury[J].Am J Pathol，2010，176（3）：1181-1192.

[14] Pezze PD，Ruf S，Sonntag AG，et al.A systems study reveals concurrent activation of AMPK and mTOR by amino acids[J].Nat Commun，2016，7：13254.

[15] Proikas-Cezanne T，Takacs Z，Donnes P，et al.WIPI proteins：essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome[J].J Cell Sci，2015，128（2）：207-217.

[16] Graef M，Friedman JR，Graham C，et al.ER exit sites are physical and functional core autophagosome biogenesis components[J].Mol Biol Cell，2013，24（18）：2918-2931.endprint

[17] Araki Y，Ku WC，Akioka M，et al.Atg38 is required for autophagy-specific phosphatidylinositol 3-kinase complex integrity[J].J Cell Biol，2013，203（2）： 299-313.

[18] Chong ZZ.mTOR： A novel therapeutic target for diseases of multiple systems[J].Curr Drug Targets，2015，16（10）：1107-1132.

[19] Sato T，Ishii J，Ota Y，et al.Mammalian target of rapamycin （mTOR） complex 2 regulates filamin A-dependent focal adhesion dynamics and cell migration[J].Genes Cells，2016，21（6）：579-593.

[20] Ber Y，Shiloh R，Gilad Y，et al.DAPK2 is a novel regulator of mTORC1 activity and autophagy[J].Cell Death Differ，2015，22（3）：465-475.

[21] 趙鴻，翼倩倩，李永霞等.mTOR復合物在糖尿病腎病小鼠腎組織中的不同分布和表達[J].解剖學報， 2014，45（4）： 555-560.

[22] 梁新華，李英，張蕾.AMPK信號通路在高糖誘導腎小管上皮細胞間質轉化中的作用[J].中國老年學雜志，2015，35（17）： 4810-4812.

[23] 張明珠.高糖環境下mTOR在腎小管上皮間質轉化中的作用及機制研究[D].徐州，徐州醫學院，2013.

[24] Liu Y，Lu Z，Cui M，et al.Tissue kallikrein protects SH-SY5Y neuronal cells against oxygen and glucose deprivation-induced injury through bradykinin B2 receptor-dependent regulation of autophagy induction[J].J Neurochem，2016，139（2）：208-220.

[25] Fu LL，Cheng Y，Liu B，et al.Beclin-1： autophagic regulator and therapeutic target in cancer[J].Int J Biochem Cell Biol，2013，45（5）： 921-924.

[26] Mei Y，Glover K，Su M，et al.Conformational flexibility of BECN1： Essential to its key role in autophagy and beyond[J].Protein Sci，2016，25（10）：1767-1785.

[27] Fogel AI，Dlouhy BJ，Wang C，et al.Role of membrane association and Atg14-dependent phosphorylation in beclin-1-mediated autophagy[J].Mol Cell Biol，2013，33（18）：3675-3688.

[28] Li L，Zepeda-Orozco D，Black R，et al.Autophagy is a component of epithelial cell fate in obstructive uropathy[J].American Journal of Pathology，2010，176（4）： 1767-1778.

[29] 向鏡芬，楊祥，龔劍鋒等.PI3 K/Akt 信號通路在膿毒癥腎臟損傷誘導的自噬中的調節作用[J].中國病理生理雜志，2014，30（6）：1052-1058.

[30] 張雅麗，崔麗艷，楊碩等.自噬對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及機制[J].臨床與實驗病理學雜志，2015，31（4）：431-435.

[31] Comel A，Sorrentino G，Capaci V，et al.The cytoplasmic side of p53s oncosuppressive activities[J].FEBS Lett，2014，588（16）：2600-2609.

[32] Kong B，Cheng T，Qian C，et al.Pancreas-specific activation of mTOR and loss of p53 induce tumors reminiscent of acinar cell carcinoma[J].Mol Cancer，2015，14：212.

[33] Zhang XD，Qi L，Wu JC，et al.DRAM1 regulates autophagy flux through lysosomes[J].PLoS One，2013，8（5）：e63245.

[34] Ranjan K，Pathak C.Expression of cFLIPL determines the basal interaction of Bcl-2 With Beclin-1 and regulates p53 dependent ubiquitination of Beclin-1 during autophagic stress[J].J Cell Biochem，2016，117（8）：1757-1768.

[35] Comel A，Sorrentino G，Capaci V，et al.The cytoplasmic side of p53s oncosuppressive activities[J].FEBS Lett，2014，588（16）：2600-2609.

[36] Takahashi A，Kimura T，Takabatake Y，et al.Autophagy guards against cisplatin-induced acute kidney injury[J].Am J Pathol，2012，180（2）：517-525.

（收稿日期：2017-06-16修回日期：2017-06-19）

（編輯：梁明佩）-±s）endprint