抗松材線蟲病赤松體細胞胚的發育和成熟萌發*

許建秀 吳小芹 葉建仁 朱麗華 吳 靜

(南京林業大學林學院 南方現代林業協同創新中心 南京 210037)

赤松(Pinusdensiflora)，主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯東南部及我國東部，可作庭院、造林的樹種，易感染松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)而大量死亡，這對林業生產和生態環境造成了嚴重破壞(朱麗華等, 2010)。采用常規種苗繁殖技術，繁殖系數低(張守攻等, 2004)，選育出的抗病材料難以滿足大規模林業生產的需求。為了大量快速繁殖已選優良抗病基因型，在短時間內實現規模化生產，對赤松離體組織培養技術的研究顯得尤為重要。

體細胞胚發生具有繁殖系數大、周期短、結構完整、再生率高、不受季節影響等特點(Guptaetal., 1980)，是植物大規模無性繁殖的一種主要手段(汪小雄等， 2006； Stasollaetal., 2003)。國內外學者已通過體細胞胚發生成功獲得50多種針葉樹體細胞胚或體細胞胚再生植株(孫志強等， 2010)，其中火炬松(Pinustaeda)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)和輻射松(Pinusradiata)等樹種體細胞胚發生已經應用于規?；a(張守攻等， 2004)。Taniguchi(2001)首次對赤松體細胞胚發生進行研究，建立了胚性細胞系并進行了體細胞胚成熟試驗，但轉化率非常低； 隨后，Maruyama等(2005； 2012)、Shoji等(2006)、Kim等(2014)研究了赤松胚性愈傷組織增殖、體細胞胚成熟、萌發及轉化的影響因子，但試驗結果存在胚性愈傷組織誘導率低、胚性愈傷組織能力的喪失、體細胞胚成熟與轉化率低等情況。國內目前對赤松組織培養器官發生及植株再生有所研究(朱麗華等， 2010； 李清清， 2012)，而對赤松體細胞胚發生的研究報道較少(吳靜等， 2015)。

完整的體細胞胚發生過程包括胚性愈傷組織的形成以及體細胞胚的形成、發育和成熟萌發等階段。為優化抗松材線蟲病赤松體細胞胚的形成、發育及成熟萌發條件，本試驗以抗病赤松的未成熟合子胚誘導形成的胚性愈傷組織為材料，進一步研究了外源激素、糖類、滲透劑、凝固劑及培養方式對抗病赤松體細胞胚發育和成熟萌發的影響，旨在對抗病赤松體細胞胚發生體系進行優化以提高其體細胞胚的質量和數量，從而提高萌發率和植株轉化率，為抗病赤松的種質資源保存、體胚苗的大規模工廠化生產提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

抗病赤松未成熟球果于2013年6月采集于江蘇句容林場抗松材線蟲病赤松種質資源庫(2004年2月從日本林木良種繁育中心引種建立)，從球果中剝離出未成熟合子胚，在DCR基本培養基(Guptaetal.，1985)上添加2.0 mg·L-12,4-D和1.0 mg·L-16-BA成功誘導出具有胚性的愈傷組織(22#-1和13#-1)，并已繼代培養7次，再經過3次繼代培養，將胚性愈傷組織生長狀況良好的2個無性系22#-1和13#-1作為體細胞胚發生的材料(吳靜等， 2015)。

1.2 ABA和PEG8000不同組合對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

以抗病赤松無性系22#-1胚性愈傷組織為材料進行兩因素隨機區組試驗，A因素脫落酸 (ABA)濃度(10，15，20 mg·L-1)、B因素聚乙二醇 (PEG) 8000濃度(100，140，180 g·L-1)。 將胚性胚柄團(embryonic suspensor mass, ESM)轉接至不同組合培養基，每處理30塊ESM，重復3次，實時觀察體胚的發育及成熟情況。培養基附加肌醇8.0 g·L-1、麥芽糖60 g·L-1、2-(N-嗎啡啉) 乙磺酸(MES)250 mg·L-1、水解酪蛋白(CH)500 mg·L-1、維生素C(VC)10 mg·L-1、谷氨酰胺(Glu)450 mg·L-1、活性炭(AC)2.0 g·L-1、植物凝膠 (phytagel)(Sigma公司)3.0 g·L-1，pH5.8。

抗病赤松體細胞胚誘導、增殖、成熟和萌發試驗在培養溫度設定為(23±2)℃的組織培養室中暗培養，每2個星期觀察1次。正常體細胞胚數(每克愈傷組織形成的正常體細胞胚數，個·g-1)=正常體細胞胚個數/愈傷組織鮮質量； 畸形體細胞胚數(每克愈傷組織形成的畸形體細胞胚數，個·g-1)=畸形體細胞胚個數/愈傷組織鮮質量； 體細胞胚數(每克愈傷組織形成的體細胞胚數，個·g-1)=體細胞胚個數(包括正常和畸形)/愈傷組織鮮質量。

1.3 碳源種類及濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

將22#-1的ESM轉接在LP基本培養基(Arnoldetal.， 2010)中，分別添加麥芽糖(20，30，45，60，70 g·L-1)和蔗糖(20，30，45，60，70 g·L-1)，每處理30塊ESM，重復3次，實時觀察體胚的成熟情況。培養基附加ABA 15 mg·L-1、PEG8000 140 g·L-1、肌醇8 g·L-1、MES 250 mg·L-1、CH 500 mg·L-1、VC 10 mg·L-1、Glu 450 mg·L-1、AC 2.0 g·L-1、植物凝膠3.0 g·L-1，pH5.8。體細胞胚培養及測定同1.2。

1.4 肌醇濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

將22#-1的ESM轉接在LP基本培養基中，添加肌醇0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，16.0 g·L-1，每處理30塊ESM，重復3次，實時觀察體胚的成熟情況。培養基附加ABA 15.0 mg·L-1、PEG8000 140.0 g·L-1、MES 250.0 mg·L-1、CH 500.0 mg·L-1、VC 10.0 mg·L-1、Glu 450.0 mg·L-1、AC 2.0 g·L-1、植物凝膠3.0 g·L-1，pH5.8。體細胞胚培養及測定同1.2。

1.5 凝固劑對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

采用2種凝固劑，分別為植物凝膠(phytagel)(Sigma公司)和瓊脂(agar powder)(西隴化工公司)。將22#-1的ESM轉接在LP基本培養基，分別添加植物凝膠(2.5，3.0，3.5，4.0 g·L-1)和瓊脂(6.0，8.0，10.0，12.0 g·L-1)， 每處理30塊ESM，重復3次,實時觀察體胚的成熟情況。體細胞胚培養及測定同1.2。

1.6 不同培養方式下抗松材線蟲病赤松體細胞胚的發育和成熟

I.液-固增殖-固成熟： 取胚性細胞系22#-1和13#-1胚性愈傷組織，轉入10.0 mL不含激素DCR液體培養基中，手持劇烈震蕩形成體細胞分布均勻且無塊狀細胞團的懸浮體系(每個細胞團大約有300萬個細胞)，用1.0 mL的移液槍吸取懸浮液，分散在滅菌后的濾紙上，待水分瀝干后，將有培養物的濾紙放入固體增殖培養基，15天之后轉入固體成熟培養基。

II.固增殖-固成熟： 直接用鑷子夾取胚性細胞系22#-1和13#-1的胚性愈傷組織于固體增殖培養基上，15天之后轉入固體成熟培養基中。

Ⅲ. 液-固成熟： 取胚性細胞系22#-1和13#-1胚性愈傷組織，轉入10.0 mL不含激素DCR液體培養基中，手持劇烈震蕩形成體細胞分布均勻且無塊狀細胞團的懸浮體系，用1.0 mL的移液槍吸取培養好的懸浮液，均勻分散在滅菌后的濾紙上，待水分瀝干后，將有培養物的濾紙放入固體成熟培養基中。體細胞胚培養及測定同1.2。

1.7 抗松材線蟲病赤松體細胞胚的萌發及植株再生

將體細胞胚22#-1放置于萌發培養基上進行萌發。萌發基本培養基為LP，添加20.0 g·L-1麥芽糖、2.0 g·L-1AC、3.0 g·L-1植物凝膠，pH5.8。非直射光培養5天左右，再放入直射光下培養15天左右，觀察體胚的萌發狀況，統計萌發率。然后將萌發的體細胞胚轉入WPM基本培養基(Pullmanetal.， 2005)，附加0.1 g·L-1肌醇、1.5 mg·L-1IBA、15.0 g·L-1蔗糖、0.2 mg·L-1NAA、7.0 g·L-1卡拉膠(福建省綠麒食品膠體有限公司)，每日光照(1 000 lx)下培養16 h、暗培養8 h，持續培養1個月，統計植株轉化率。植株轉化率(%)=生根的植株數/萌發正常體細胞胚的個數×100%; 萌發率(%)=萌發正常體細胞胚的個數/接種體細胞胚個數×100%。

還有一種，比如說同時期的不同題材的作品來進行對比。就拿郁達夫在1927年寫的東西作例子。郁達夫在1927年有一個很奇怪的現象，就是他的論文和雜文都是慷慨激昂的，可以舉例如《在方向轉換的途中》《公開狀答日本山口君》《無產階級專政和無產階級文學》《訴諸日本無產階級文藝界同志》。從這四篇論文或雜感來看，他是慷慨激昂的。甚至有一篇題目叫《無產階級專政和無產階級文學》，1927年寫這樣的文章也就很慷慨激昂了，但是在1927年他的小說比如《過去》《迷羊》《清冷的午后》，從這些小說來講，都是很失望的，甚至是絕望的。那么這樣一對比，將這些資料一排比，我覺得也能夠得出論點。

1.8 抗松材線蟲病赤松再生植株的移栽

待再生植株根伸長2.0 cm左右后移栽，為使幼苗能更好地適應外界的環境，移栽前7天要逐漸把封口膜揭開，移栽的時候要把幼苗根部的培養基洗掉，移栽在苗圃土、珍珠巖和河沙構成1∶1∶2的基質中。移苗1個月內注意保持溫度(23 ℃±2 ℃)、基質濕度(85%±2%)和空氣濕度(90%～95%)。4個月后統計移栽成活率。移栽成活率(%)=植株成活的株數/移栽的株數×100%。

1.9 數據處理

采用Excel 2003處理試驗數據，并用SPSS17.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗，采用Duncan方法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同ABA和PEG8000組合對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

不同ABA 和PEG8000濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚成熟具有顯著影響(表1)。在 ABA為 15 mg·L-1、PEG 為140 g·L-1的濃度組合下，正常體細胞胚數達到171個·g-1，均高于其他處理； 當 ABA濃度為20 mg·L-1時，正常體細胞胚數都偏低(79個·g-1)。添加適當濃度的 ABA 可促進體細胞胚單個化并進一步發育成熟。PEG在合適的濃度下，促進體細胞胚的成熟。本試驗結果表明 PEG 對抗病赤松體細胞胚成熟誘導具有顯著影響。當 PEG 濃度達到180 g·L-1時，正常體細胞胚數反而有所下降，可見 PEG 的使用并非濃度越高正常體細胞胚數就越多，它們之間并不存在正相關。試驗表明，ABA濃度為15 mg·L-1和PEG8000 140 g·L-1的組合最適宜抗松材線蟲病赤松的體細胞胚成熟。

表1不同ABA和PEG8000濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響①
Tab.1EffectofABAandPEG8000withvariousconcentrationsonsomaticembryosinnematode-resistantPinusdensiflora

ABA/(mg·L-1)PEG8000/(g·L-1)體細胞胚數Numberofsomaticembryos/(embryo·g-1)正常體細胞胚數Numberofnormalsomaticembryos/(embryo·g-1)畸形體細胞胚數Numberofabnormalsomaticembryos/(embryo·g-1)10100121±551c48±4．65e10140112±379d67±2．00d1018097±400e43±12．29e1510090±252f46±1．53e15140171±624a25±2．00f15180129±208b31±1．53f2010098±252e77±1．53c2014089±379f93±1．00b2018079±306g119±3．74a

①不同字母表示Duncan檢驗差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference atP<0.05 in Duncan’s test. The same below.

2.2 肌醇濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

試驗研究表明(圖1)，在缺乏肌醇的情況下，抗松材線蟲病赤松雖能產生子葉胚，但是子葉胚胚頭膨大，胚柄短小甚至不能正常發育，胚體短而粗，顏色偏黃，生長不良，均為畸形胚； 而且愈傷組織顏色偏褐，結構逐漸緊密，生長狀況明顯衰退(圖1a)。當加入肌醇時，抗病赤松體細胞胚數明顯提高。而肌醇濃度大于8.0 g·L-1時，體細胞胚數劇增，但出現的均為畸形胚，胚頭膨大，胚柄短小，生長不佳(圖1f，g)。因此肌醇的最適濃度為8.0 g·L-1，體細胞胚數最高達到179個·g-1(圖1e)。胚性愈傷組織直接放置于添加了肌醇的成熟培養基中，沒有在中間過渡培養基中培養，因此可以縮短2～3周培養時間，在8周前后就形成了成熟的子葉胚。

2.3 碳源對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

不同碳源類型及濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚成熟的影響存在顯著差異，麥芽糖比蔗糖增加抗病赤松正常體細胞胚數的效果明顯(P<0.05)(圖2)。麥芽糖濃度為60 g·L-1時，抗病赤松正常的體細胞胚數達到235個·g-1，而且畸形胚也降到5個·g-1； 當麥芽糖和蔗糖濃度升高時，體細胞胚數降低并且畸形胚增多； 當麥芽糖和蔗糖濃度低于60 g·L-1時，體細胞胚數少。因此，抗病赤松體細胞胚成熟培養基中，麥芽糖比蔗糖更適宜抗病赤松的體細胞胚發育和成熟，最適濃度為60 g·L-1。

2.4 凝固劑對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

試驗結果表明，由于培養基中添加了聚乙二醇(PEG)，凝固劑瓊脂從6.0 g·L-1添加至12.0 g·L-1時，培養基都不能凝固，愈傷組織無法生長，也無子葉胚形成。當加入植物凝膠且濃度為3.0 g·L-1，培養基凝固，軟硬適中，產生的子葉胚細長，發育正常，生長良好； 當植物凝膠濃度為2.0 g·L-1，子葉胚生長良好，但是培養基較軟，不易固定； 當植物凝膠濃度增為3.5 g·L-1時，培養基開始偏硬，只出現少量

圖1 肌醇濃度對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響Fig.1 Effect of inositol concentration on somatic embryos maturation in nematode-resistant Pinus densifloraa-g: 肌醇濃度分別為0, 2, 4, 6, 8, 10, 16 g·L-1Inositol concentration is 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16 g·L-1, respectively.

培養情況Cultivationsituation培養方式CulturemethodⅠ．液-固增殖-固成熟Liquid?solid?proliferationsolidmaturationⅡ．固增殖-固成熟Solid?proliferationsolidmaturationⅢ．液增殖-固成熟Liquid?proliferationsolidmaturation基因型Genotype13#?122#?113#?122#?113#?122#?1胚性愈傷組織鮮質量Freshmassofem?bryogeniccallus/g101010101010成熟時間Maturationtime/week11～1210～119～109～1012～1412～14正常體細胞胚數Numberofnormalso?maticembryos/(embryo·g-1)215±569b239±473a203±624b205±777b134±1100d154±1100c畸形體細胞胚數Numberofabnormalso?maticembryos/(embryo·g-1)45±252c25±586d69±681b52±306c92±252a97±351a

非正常的子葉胚； 當植物凝膠濃度增為4.0 g·L-1時，培養基過硬，愈傷組織干燥、顏色發白，未形成子葉胚。因此，在抗病赤松發育成熟階段宜選用植物凝膠濃度為3.0 g·L-1，可獲得質量較好的子葉胚。

2.5 培養方式對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響

圖2 碳源對抗松材線蟲病赤松體細胞胚發育和成熟的影響Fig.2 Effect of different sugars on somatic embryo maturation in nematode-resistant Pinus densiflora

2.6 抗松材線蟲病赤松體細胞胚萌發及植株再生

抗松材線蟲病赤松體細胞胚成熟時，正常子葉胚呈現乳白色或者乳黃色，子葉完全張開，可以清楚地看到有幾個子葉，并出現明顯的黃色細長胚軸和紅色胚根(圖3a1,a2)； 畸形子葉胚呈現乳白色或者乳黃色，子葉未張開或胚頭膨大，胚軸短小甚至不能正常發育，胚根未形成或有紅色根點(圖3b1,b2)。

將不同發育階段產生的成熟體細胞胚輕輕挑出，轉至無激素的萌發培養基，散射光培養5天后，體細胞胚子葉由黃白色逐漸變為黃綠色(圖3c1,c2)，把子葉胚放在日光燈下培養。在光照之后，正常萌發的子葉逐漸張開，顏色轉變為深綠色； 胚軸伸長，基部呈現紅色微小根尖(圖3d1)，后根尖逐漸變為深褐色，根部生長。正常萌發的子葉胚子葉張開，胚軸伸長，基部有微小紅色根點(圖3d1)，而畸形的子葉胚子葉很小，未張開或者不規則張開，胚軸很短或者幾乎沒有，基部有一點紅色小根點或者沒有，基部愈傷化嚴重(圖3d2,d3)。隨后將萌發的體細胞胚轉入WPM培養基中，1個月后長出初生針葉，形成再生植株： 正常的子葉胚胚軸較長，胚根伸長，1個月后長出初生針葉，嫩白色根長1.0 cm左右(圖3e1,f1)； 畸形胚胚軸較短，根部的愈傷組織嚴重(圖3e2,f2)。在WPM壯苗培養基中生長3個月后，正常子葉胚初生針葉繼續生長，有的還長出了次生針葉，根部嫩白色，并只有1條主根，主根周圍長出許多須根(圖3g1)，這時可以直接移栽； 而畸形子葉胚在WPM壯苗培養基中生長3個月后，初生針葉雖繼續生長，但未見有次生針葉，根部棕褐色，愈傷化嚴重，有的還長出若干側根(圖3g2)，移栽100株，全部死亡。體細胞胚的萌發率和植株轉化率分別為67.2%和46.5%。

2.7 抗松材線蟲病赤松體細胞胚再生植株的移栽

正常子葉胚移栽之后，體細胞胚再生植株(圖3h1)生長較幼嫩，移栽3個月后體細胞胚再生植株(圖3h2)都長出次生針葉，根系深入土壤。移栽體細胞胚再生植株為202株，成活株數為66株，移栽成活率為32.7%。

3 討論

圖3 抗松材線蟲病赤松體細胞胚成熟、萌發及植株再生Fig.3 Somatic embryo maturation, germination and plant regeneration of nematode-resistant Pinus densifloraa1, a2. 正常子葉胚; b1,b2. 畸形子葉胚; c1, c2. 萌發培養基中5天后的體細胞胚; d1,d2,d3. 萌發培養基中20天后體細胞胚形成的再生植株; e1, e2. WPM培養基中壯苗的再生植株; f1, f2. WPM培養基中壯苗1個月的再生植株; g1, g2. WPM培養基中壯苗3個月的再生植株; h1. 移栽后的體細胞胚苗; h2. 移栽后3個月的體細胞胚苗。a1,a2. Normal cotyledon embryo; b1,b2. Abnormal cotyledon embryo; c1,c2. Somatic embryos on germination medium after five days; d1,d2,d3. Plant regeneration from somatic embryogenesis on germination medium after twenty days; e1,e2. Plant regeneration in WPM medium; f1,f2. Plant regeneration in WPM medium after one month; g1,g2. Plant regeneration in WPM medium after three months; h1. Transplanting somatic embryo plantlets; h2. Somatic embryo plantlets three months after transplanting.

體細胞胚成熟是植株能否再生的關鍵所在，與激素種類和濃度、培養方式、培養基滲透壓等有關。ABA 已被用于許多樹種提高體細胞胚的質量，防止早熟發芽，提高萌發率和轉化率(Capuanaetal., 1997)。研究表明，滲透壓在針葉樹體細胞胚的發育過程中起到了重要的作用，一般是利用聚乙二醇(PEG)作滲透劑，來提高培養基的滲透壓。很多研究證實在成熟培養基中同時使用ABA 和 PEG 有利于提高體細胞胚的數量和質量(Attreeetal., 1989)。黃健秋等(1995a)研究了云南松(Pinusyunnanensis)體細胞胚發生，結果表明PEG與ABA同時使用，幾周可形成粗壯的子葉胚。Yildirim等(2006)研究表明，土耳其紅松(Pinusbrutia)體細胞胚成熟的最適激素組合為80 μmol·L-1ABA和3.75%PEG。本試驗表明，當 ABA 濃度為 15.0 mg·L-1以及PEG8000濃度為 140 g·L-1時，正常體細胞胚數達到171個·g-1，均高于其他處理。因此，添加適當濃度的 ABA和PEG 可促進抗松材線蟲病赤松體細胞胚的個體發育和成熟。此外，培養基中額外添加肌醇、山梨醇等均可產生高滲透壓條件，促進體細胞胚發生，防止其早熟萌發，其中以肌醇最為有效(黃健秋等，1995a)。本試驗表明，肌醇的濃度為8.0 g·L-1時，抗松材線蟲病赤松的正常體細胞胚數最多； 肌醇濃度大于8.0 g·L-1時，體細胞胚數劇增，但多數為畸形胚； 而當肌醇濃度低于8.0 g·L-1或不添加時，大多為畸形胚，愈傷組織顏色偏褐，結構逐漸緊密，生長狀況明顯衰退。因此，肌醇的濃度以8.0 g·L-1最適宜抗松材線蟲病赤松的體細胞胚成熟。黃健秋等(1995b)及唐巍等(1998)分別將馬尾松(Pinusmasssoniana)、火炬松早期原胚轉入含9 000 mg·L-1肌醇的培養基上培養，形成后期原胚后，再將后期原胚轉入成熟培養基中進行體細胞胚成熟； 而在本試驗中，抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織直接放置于添加了肌醇的成熟培養基中，沒有在中間過渡培養基中培養，因此可以縮短2～3周培養時間，在8周前后就形成了成熟的子葉胚，加快了抗松材線蟲病赤松體細胞胚發生的進程。

在植物體細胞胚的發育過程中，不同種類及其濃度的碳源起到至關重要的作用。碳源既可以作為能量物質，又可作為滲透調節劑對體細胞胚的發育與成熟起到促進作用。本試驗結果顯示，麥芽糖比蔗糖更能增加抗松材線蟲病赤松體細胞胚的數量。其中麥芽糖濃度為60 g·L-1時，抗病赤松體細胞胚數達到235個·g-1，而且畸形胚也降到最低。當蔗糖和麥芽糖濃度升高時，體細胞胚數降低且畸形胚也較多，這與Li等(1998)和Shoji等(2006)的研究結果一致。

凝固劑在培養基中起固定支撐作用，不同種類凝固劑有可能影響到培養基的物理結構和培養物對營養成分的吸收利用。張巧等(2010)研究表明： 以植物凝膠(phytagel)作為凝固劑，提高了陸地棉(Gossypiumhirsutum)體細胞胚發生和植株再生頻率。本研究以抗松材線蟲病赤松22#-1胚性愈傷組織為材料，比較了2種不同凝固劑瓊脂(agar powder)和植物凝膠培養基對抗病赤松體細胞胚發生的影響。結果表明： 植物凝膠濃度為3.0 g·L-1時，培養基凝固，軟硬適中，產生的子葉胚細長，發育正常，生長良好； 而成熟培養基中加入PEG8000，瓊脂作為凝固劑無法凝固培養基。故植物凝膠對抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織的誘導、增殖和體細胞胚成熟均具有良好作用，但考慮到植物凝膠價格因素，在胚性愈傷組織的誘導和增殖過程中可使用較廉價的瓊脂，而在體細胞胚成熟和萌發過程中應使用植物凝膠。

植物體細胞胚的培養方式有固體培養、液體懸浮培養、固-液結合培養，培養方式對體細胞胚發生具有顯著影響。以往培養方式是松屬(Pinus)樹種胚性愈傷組織以團塊的形式夾取到成熟培養基中，但是此方式需要大量的胚性愈傷組織(Keinonen-Mett?l?etal., 1996)。而現在將胚性愈傷組織放入有生長調節劑的懸浮液中生長來最大化地產生體細胞胚(Klimaszewskaetal., 2007)，每皿(7 cm)胚性愈傷組織起始量在50 mg(Carnerosetal., 2009)到500 mg(Maruyamaetal., 2007)。本試驗對固體培養、液體懸浮培養、固-液結合培養3種培養方式進行了比較，結果表明： 液-固增殖-固成熟方式的正常體細胞胚數最高且畸形體細胞胚數最低，雖成熟時間較固增殖-固成熟方式多了3周左右，但同步化程度高，所需材料少，因此，該方式適合進行抗病赤松體胚成熟試驗。最近的研究發現，歐洲赤松(Pinussylvestris)液-固培養比固-固培養能夠產生更多良好的細長型的體細胞胚，原因是液-固培養中的胚性愈傷組織在較薄的濾紙上比固-固培養能夠更好地吸收營養物質并產生大量的體細胞胚(Lelu-Walteretal., 2008)。

植物體細胞胚的萌發與植株再生培養基的調節有利于提高萌發率和植株轉化率。齊力旺等(2004)研究表明附加IBA和NAA的萌發培養基可以促進華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)體細胞胚根的發生。本試驗研究發現，附加1.5 mg·L-1IBA和0.2 mg·L-1NAA的WPM植株再生培養基有利于促進抗松材線蟲病赤松根的發生，體細胞胚的萌發率和植株轉化率高，分別為67.2%和46.5%。研究中發現，僅挑出質量好的體細胞胚進行萌發是能夠成功獲得良好的植株再生苗的關鍵因素之一(Aronenetal., 2009)。本試驗中，高質量的體細胞胚可以轉化為良好的植株再生苗，而低質量的體細胞胚最終移栽不成活，這表明高質量的體細胞胚能夠提高體細胞胚的萌發率和植株轉化率。此外在本試驗中再生植株壯苗利用WPM培養基，3個月之后再生植株根伸長3.0 cm左右，這表明WPM培養基能促進植株生長和根的進一步伸長。

4 結論

將抗松材線蟲病赤松胚性愈傷組織置于15.0 mg·L-1ABA、140 g·L-1PEG8000、8.0 g·L-1肌醇、60 g·L-1麥芽糖、3.0 g·L-1植物凝膠的LP培養基上，以液-固增殖-固成熟培養方式培養，成功獲得了高質量的體細胞胚和再生植株，體細胞胚的萌發率和植株轉化率分別為67.2%和46.5%，再生植株移栽3個月后成活率為32.7%，為抗病赤松的大規模繁殖和工廠化生產提供了技術支持。

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