活體光學顯微成像技術應用于經絡實質研究展望

齊悠克 劉進進（通訊作者）

（湖北省中醫院 湖北 武漢 430061）

經絡學說是中醫學理論基礎的重要部分，是針灸療法的理論基礎，起著重要的指導辨證治療的作用。國內外大量研究，證實了其感傳性、聲電熱等理化特性，論證了其確實存在性。然而經絡的實質到底是什么卻一直缺乏直接的證據。熒光探針和新型顯微鏡技術的發實現了生理病理過程中關鍵生物學過程如活體內細胞、亞細胞結構、分子間互作的實時、可視化觀察。本文基于經絡實質部分證據，介紹熒光探針結合活體光學顯微成像技術，探討該技術應用于經絡實質研究的可行性及發展展望。

1.經絡實質的研究

《靈樞·九針十二原》有載：“刺之要，氣至而有效，效之信，若風吹云，明乎若見蒼天。”，說明“氣至”的經絡現象作為經絡實質研究的切入點有重要價值。對經絡實質，許金森[1]認為要抓住經脈的特異性循行路線及其與調控人體機能的關系這一最核心的內容，主要特點就是“循經”。

林繼海等[2]通過免疫組化方法觀察到人體截肢標本一些主要穴位肥大細胞（MC， Mast Cell）數量較非穴區多。陳良為等[3]觀察到MC與神經末梢間特殊的形態學聯系， 認為可能是引起循經感傳的結構基礎。鄧云平[4]等觀察發現針刺后大鼠足陽明胃經穴區MC數目明顯增加，部分MC形態發生變化，可能與MC脫顆粒及趨化游走后形態改變有關。

Langevin等[5]發現，大部分穴位和經脈線與結締組織有對應關系。郭義等[6]發現針刺家兔經穴后Ca2+濃度明顯高于非穴區，且后Ca2+有沿經線重新分布的趨勢。丁光宏等[7]的模型得到了組織液定向流動與局部血液流動、膠原纖維多孔率滲透率等變量間的關系，佐證MC在循經感傳現象中起重要作用。

缺失肢體的幻肢循經感傳現象、胸壁組織離斷下循經感傳跨越切口傳導等[8]，提示經絡實質應有中樞神經的參與。鄭翠紅[9]等發現縫隙連接蛋白Cx43在穴區和經脈沿線的高表達，并且針刺能提高其表達，抑制該蛋白表達能部分抵消針刺的治療作用，于是提出的猜想：經絡系統傳輸信號由縫隙連接蛋白組成通道，神經遞質、鈣離子充當信使，同時大腦對信號有整合作用。

2.活體光學顯微成像技術簡介

活體光學顯微成像技術目前已有廣泛應用，以觀察存活組織或存活動物體內免疫細胞與腫瘤細胞互作、神經元活動等，分子層面用于觀察活細胞內分子構象改變、分子互作、分子示蹤與定量檢測等。2014年諾貝爾化學獎頒給了Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner，表彰了其在超高分辨率熒光顯微鏡領域的貢獻，也是對熒光顯微成像技術的再次肯定。

2.1 熒光探針

根據熒光基團的不同，可分為有機小分子熒光探針、熒光蛋白探針、納米材料探針等。常用的有通過病毒轉染和轉基因在神經元內表達以熒光鈣調蛋白為代表的基因編碼類鈣指示劑（GECI，genetically encoded calcium indicator（可以對神經元的活動和結構變化進行觀測。熒光探針依據不同的信號轉換機理達到不同的檢測目的，主要有光致電子轉移（PET，photo-induced electron transfer）、分子內電荷轉（ICT，intramolecular charge transfer）、熒光共振能量轉移（FRET，fluorescence resonance energy transfer）、跨鍵能量轉移（TBET，through-bond energy transfer）。基于FRET原理的探針因其工作原理對熒光基團間距離有著嚴格的要求，常作為蛋白質互作、蛋白動力學研究工具，如利用基于FRET原理的探針，Ma等[10]觀察了T細胞受體的蛋白動力學變化。

當滿足一定條件下，熒光分子可以同時吸收兩個能量較小波長較長的光子，輻射出比激發光光子能量高的光子，稱為雙光子熒光效應，其發生概率極小，需要極高峰值功率的飛秒激光作為光源。雙光子熒光探針采用能量較低的近紅外激發、有更深的組織穿透性、對組織的光損傷較小、避免了組織自發熒光的干擾等。

2.2 新型顯微技術

為了對體層深部的組織進行成像，需要激光共聚焦顯微術、雙光子顯微術、光纖式內窺鏡技術等技術的互相結合，其在腦科學研究的運用給經絡實質的研究帶來啟發。

2017年中國科學十大進展報道了北京大學程和平和陳良怡研究組等研制的微型化佩戴式雙光子熒光顯微鏡，其以光纖作為輸送激光的點光源，也作為分散雜散光的探測器作用，雖然由于裝置重量限制限制未采用共聚焦光路不能對z軸進行變焦，其僅有的2.2克重量，能在小鼠懸尾、跳臺、社交等自然行為條件下，記錄其大腦神經元和神經突觸活動的高速高分辨圖像[11]。對于經絡實質研究，短期內的需求可能并沒有腦科學這么嚴苛，比如觀察部位可以不是顱內，活體觀察的組織完整性要求較低，實驗動物也不必是自由活動狀態，故而光纖內窺鏡結合雙光子熒光顯微技術在經絡實質的研究中應用的十分具有可行性及發展前景。

3.結論

尋找經絡實質的切入點在于對循經感傳現象的研究。循經感傳現象的特殊性，需要實時原位的進行活體動物顯微成像。其中肥大細胞和神經元間通過神經遞質或者及細胞結構聯系間的互作可能是十分重要的環節。光纖內窺鏡結合雙光子熒光顯微技術在經絡實質的研究中十分有前景。隨著針對性熒光探針和高時空分辨率的雙光子顯微鏡性能的不斷開發，經絡實質的研究將迎來新的機遇。