豬瘟疫苗中牛病毒性腹瀉病毒污染現狀及鑒別檢測方法研究進展

李 嬌，謝金文，王文秀，李 峰，沈志強，

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東 濱州 256600）

豬瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）分別是豬瘟（classical swine fever,CSF）和牛病毒性腹瀉（Bovine viral diarrhea,BVD）的致病原[1]，其中豬瘟是目前危害我國養豬業健康發展的頭號殺手，我國主要采取以疫苗免疫為主的綜合防控措施[2]，BVDV除感染牛外還可感染豬、羊、以及野生動物，豬感染BVDV可出現類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化[3]。CSFV與BVDV同屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus），兩者的核苷酸序列同源性在60%以上，氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清學交叉反應[1，4]。豬瘟疫苗在生產過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等原輔料，原輔料中若帶有BVDV抗體將抑制豬瘟病毒的體外培養，降低豬瘟疫苗中病毒含量和疫苗效力，導致豬瘟疫苗質量不合格。原輔料中若帶有BVDV抗原將會造成豬瘟疫苗中BVDV外源病毒污染，污染了BVDV的豬瘟疫苗免疫豬群后將對豬瘟疫苗的免疫效果產生干擾作用，BVDV在抑制豬瘟抗體產生的同時，可以刺激豬只產生大量針對BVDV的抗體，而在豬瘟抗體監測時檢出的高水平抗體效價中豬瘟保護性抗體較少，大部分可能為BVDV抗體，導致豬瘟疫苗的免疫失敗，且BVDV污染的豬瘟疫苗免疫后可使豬群感染BVD，給豬瘟的防控帶來極大的安全隱患和不確定因素[5]。筆者就目前我國豬瘟疫苗中BVDV的污染現狀及BVDV污染的鑒別診斷方法進行綜述，為提高我國豬瘟疫苗質量、保障豬瘟疫苗免疫效果、提升豬瘟綜合防控水平提供參考與借鑒。

1 流行現狀

鞠厚斌等[6]為調查我國豬瘟疫苗中BVDV的污染情況，采用RT-PCR方法對國內市場銷售的6家豬瘟疫苗生產廠家的15份豬瘟活疫苗進行了BVDV的核酸檢測，BVDV核酸陽性污染率為26.7%。曹玉美等[7]采用RT-PCR方法對7個豬瘟疫苗生產廠家的兔源豬瘟疫苗和細胞源豬瘟活疫苗共計10批次樣品進行了BVDV污染的檢測，在兔源豬瘟疫苗中未檢測到BVDV，但在8批次細胞源豬瘟疫苗中檢出7批次BVDV污染，陽性污染率高達87.5%。陶潔等[8]采用RT-PCR方法對國內相關疫苗廠家2013年生產的10份不同批次豬瘟疫苗進行了BVDV污染的篩查，共檢測出陽性樣品1份，陽性污染率達10%。葉兆美[9]為了解四川地區規模化豬場所用豬瘟疫苗中BVDV的污染情況，采用RT-PCR方法對10份豬瘟活疫苗進行RT-PCR檢測，BVDV污染率為10%。范仲鑫等[10]為了調查湖南省豬瘟細胞苗中BVDV的污染情況，應用RT-PCR方法對湖南省內銷售的10個生產廠家48個批次的豬瘟疫苗進行了BVDV的核酸檢測，10個生產廠家的豬瘟疫苗中有5個生產廠家檢出BVDV核酸陽性，48個批次中有9批次檢出BVDV核酸陽性，陽性污染率達18.75%，表明當前湖南省豬瘟疫苗中BVDV污染較嚴重。張志等[11]采用巢式RT-PCR方法對7份豬瘟疫苗進行BVDV污染的檢測，并分析BVDV核酸序列的遺傳特性，共檢測出3份BVDV陽性樣品，陽性污染率達42.86%，分子遺傳分析表明污染的BVDV均屬于BVDV-1型。祖立闖等[12]應用套式RT-PCR方法對生產豬瘟疫苗的原輔料、半成品以及成品疫苗等51份樣品進行BVDV污染的檢測，共檢出陽性樣品22份，陽性率達43.14%，所有陽性樣品經測序鑒定均為BVDV-1型。范學政等[13]應用RT-PCR方法對23個批次的豬瘟疫苗進行BVDV污染的檢測發現，有5批次疫苗污染BVDV，陽性污染率為21.74%，經測序鑒定均為BVDV-1型。以上病原學調查資料共同表明，BVDV在國內豬瘟疫苗中已具有一定的污染，且在個別地區陽性污染率較高，污染情況比較嚴峻，這將給豬瘟疫苗的產品質量和豬瘟疫病的綜合防控帶來極大的安全隱患和不確定因素，應加強重視。

2 鑒別檢測方法

目前《中華人民共和國獸藥典》（2015年版）中豬瘟疫苗BVDV污染的檢測方法為細胞培養法[14]，但該方法檢測時間較長、操作較復雜、不適合快速檢測，亟待建立可以準確區分BVDV和CSFV的敏感、特異的鑒別診斷方法。由于BVDV和CSFV存在高度的抗原交叉性和血清學交叉反應，對于豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別診斷，主要依靠基于BVDV和CSFV核酸序列差異的分子生物學方法和基于高特異性單克隆抗體的血清學方法。

2.1 細胞培養法

細胞培養法為我國獸藥典中推薦使用的方法，該方法通過接種易感細胞、觀察病變特征等進行判定。陶潔等[15]對上海某豬場送檢的一份疑似BVDV污染的豬瘟疫苗進行了BVDV的分離與鑒定，將豬瘟疫苗樣品接種于MDBK細胞，盲傳15代后仍無致細胞病變效應，但間接免疫熒光試驗表明接種該疫苗后的MDBK細胞能夠被BVDV-2型的單克隆抗體BZ-53識別，采用BVDV-1和BVDV-2的5'-UTR的通用檢測引物和針對BVDV E2的引物對病毒RNA進行RT-PCR檢測，樣品能夠擴增出約288 bp的BVDV特異性片段，測序分析結果表明分離株屬于BVDV-2型，并且其E2基因與牛源XJ-04株（BVDV-2型）的E2基因同源性最高（92.3%），而與豬源ZM-95株（BVDV-1型）E2基因同源性較低（64.5%），表明該豬瘟疫苗中的確污染有1株BVDV-2株。細胞培養法為動物病毒鑒定的經典方法，但該方法存在試驗周期長、操作繁瑣、檢測成本高，且受細胞影響較大、有些非致病變的BVDV毒株無法檢測、不適合大批量樣品檢測等缺點，使之無法成為BVDV污染最有效、便捷的鑒別檢測方法。

2.2 分子生物學方法

分子生物學檢測方法能夠檢測到病原體特定的核苷酸序列，可用于豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別診斷。李晶梅等[16]參考GenBank中BVDV和CSFV標準株的基因組序列，選取各自的保守基因區域設計可以進行鑒別檢測的特異性引物，經過對PCR反應條件的優化，建立了可以對兩種病毒同時檢測的雙重RT-PCR方法，該檢測方法特異性強、敏感性高，可以用于豬瘟疫苗的質量控制，為兩種病毒的交叉污染的檢測提供一種方便、快捷的方法。祖立闖等[12]根據GenBank公布的BVDV全基因組序列，選擇BVDV保守性比較高的5'非編碼區，利用Oligo 6.0軟件設計了2對特異性引物，建立了檢測BVDV的套式RT-PCR方法，該方法檢測CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、MDBK正常細胞、牛傳染性鼻氣管炎病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，該方法第1輪引物的檢測靈敏度可達到1 ng RNA，第2輪引物的檢測靈敏度可達到0.1 ng RNA。套式RT-PCR方法極大地提高了常規RT-PCR檢測方法的特異性和敏感性，重復性好、特異性強、敏感性高，可以準確快速檢測出極低含量的BVDV，為動物與疫苗生物制品原輔料中BVDV的快速低含量檢測提供了一種簡單、特異、敏感、快速的檢測方法。葛玉鳳等[4]為建立一種快速檢測豬瘟疫苗中BVDV污染的方法，根據GenBank上登錄的BVDV 5'端非編碼區基因組序列設計1對引物，經一步法RT-PCR反應條件的優化，建立了檢測豬瘟疫苗中BVDV污染的一步法RT-PCR方法。該方法對CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環病毒2型、豬偽狂犬病病毒、牛副流感病毒3型、牛傳染性鼻氣管炎病毒的擴增結果均為陰性，對BVDV基因組RNA的檢測靈敏度達0.1 ng，與細胞培養法的符合率達100%，應用該方法對豬瘟疫苗、牛血清等138份樣品進行BVDV污染的檢測，陽性污染率達11.59%。一步法RT-PCR檢測方法采用一步法RT-PCR擴增試劑盒，使反轉錄與PCR擴增一步完成，雖然使用商品化的試劑盒提高了檢測成本，但也節省了檢測時間，減少了操作步驟，降低了污染概率，同時具有良好的特異性、敏感性、準確性和適用性，可用于豬瘟疫苗生產中血清、細胞、毒種、半成品等的質量控制以及豬瘟疫苗臨床應用中的質量檢驗。

2.3 血清學方法

BVDV和CSFV之間存在高度的血清學交叉反應性，因而難以用普通的血清學方法將BVDV和CSFV區分開。單克隆抗體具有高度的特異性和敏感性，能夠識別病毒抗原結構的微小差異，因此，利用BVDV特異性單克隆抗體可以建立區分BVDV和CSFV的血清學診斷方法，進而實現豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測。范晴等[17]用兔抗BVDV多抗作為包被抗體，BVDV NS3單克隆抗體作為捕獲抗體，建立了檢測BVDV抗原的捕獲ELISA方法，該方法檢測CSFV、牛輪狀病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛分支桿菌均為陰性，其最低可檢測7.9×103個TCID50的病毒量，與RT-PCR方法的符合率為100%，所建立的BVDV抗原捕獲ELISA方法快速、特異、敏感，可用于BVDV抗原的鑒別檢測。

3 小結與展望

我國現階段豬瘟流行形勢復雜，豬瘟防控任務仍十分艱巨，豬瘟疫苗質量將是影響豬瘟綜合防控的關鍵，而現階段的病原學調查表明我國豬瘟疫苗中存在一定的BVDV污染，必須加強豬瘟疫苗中BVDV污染的嚴格監測，一方面要加強牛血清等原輔材料的生產與安全管理，從源頭上遏制BVDV污染的可能性；另一方面要加強疫苗制備中各個環節的監督管理，提高疫苗制備工藝的安全性和嚴謹性，逐步提高豬瘟疫苗質量，禁止生產和接種BVDV污染的豬瘟疫苗。在豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測方法方面，分子生物學方法彌補了細胞培養法試驗周期長、操作復雜以及部分BVDV毒株在細胞上難以產生明顯細胞病變等問題，且操作簡單、檢測快速，一般實驗室均可選擇使用。基于單克隆抗體的血清學檢測方法操作簡單、檢測快速、高通量，非常適合進行大批量樣品檢測。相信隨著分子生物學和免疫學技術的不斷進步，BVDV和CSFV鑒別檢測方法的逐步完善，豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測方法將逐步提高，豬瘟疫苗中BVDV的污染率將逐步降低，我國豬瘟疫苗質量將不斷提高，從而保障我國豬瘟防控事業的穩定發展。