白花前胡丙素對人肺癌A549細胞B7H3表達的調節作用

陳清閣 王雄彪(通訊作者)

（上海中醫藥大學附屬普陀醫院呼吸科 上海 200062）

B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達抑制了T細胞對腫瘤細胞的免疫活性，造成腫瘤細胞的免疫逃逸。B7H3的高表達與淋巴結轉移、TNM分期明顯相關，是一個重要的肺癌治療靶點。Pra-C是中藥前胡中重要提取物之一，本實驗通過檢測Pra-C對人肺癌A549細胞B7H3表達、基因水平的調節，探討Pra-C對共刺激分子B7H3的調節作用。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源及培養 人肺癌細胞A549由上海中國科學研究院細胞庫提供，常規培養于雙抗和10%小牛血清的RPMI1640培養液中，在37℃、5%CO2的條件下培養。

1.1.2 實驗試劑與儀器 RPMI-1640培養基（Gibco）；Pra-C（成都曼徹斯特）；雙熒光素酶檢測試劑盒（Promega）；B7H3引物與探針（閃晶），ABI7300全自動熒光定量PCR儀（美國ABI公司）等。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術 A549細胞以5×104個/孔接種于24孔板，加藥48h后分別收集于流式細胞管中，清洗后調整每管體積為50μL；加入B7H3-PE抗體5μL，4℃避光30min；加300μL D-Hanks緩沖液，上機。

1.2.2 Real-Time PCR 反應條件：94℃ 10min，94℃ 30s，60℃ 1min，40個循環，以GAPDH基因作為內參，引物序列如下：B3H3-F5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；B3H3-R5’-CCTCTGGGGGGAATGTCATA-3’；B3H3-probe 5’-GTGGTGCTGGGTGCAAT-3’；GAPDH-F 5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；GAPDH–R5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’；GAPDH-probe 5’-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’

1.2.3 B7H3-PGL3報告基因的構建 設計人B7H3啟動子引物，B7H3-F5’-gcGGTACCCGGTTCCTCCCTTCATAGC-3’；B7H3-R CCTGAGTCCCAGAGTCG；擴增產物長度為1240bp，轉化感受態細胞，篩選克隆，測序結果正確后樣本質粒提取。

1.2.4 熒光素酶實驗 將B7H3-PGL3質粒轉染至A549細胞中，分為Pra-C40μmol/ml組、IFN-γ組、空白對照組，24小時后，GloMax20/20發光檢測儀檢測相對熒光強度。

1.3 統計學方法

應用SPSS 21.0統計軟件，本實驗數據為計量資料，實驗數據以±s表示，采用SNK-q檢驗比較多組間差異，計量資料采用兩獨立樣本t檢驗比較兩組間差異，以P＜0.05為有統計學意義。

2.結果

2.1 Pra-C可以下調A549細胞B7H3蛋白的表達

SNK-q檢驗不同處理組間A549細胞B7H3蛋白的表達差異，發現Pra-C濃度在40μmol/ml、20μmol/ml、10μmol/ml時B7H3蛋白的相對表達量分別為（0.235±0.01）（0.38±0.009）（0.43±0.004），其下調作用具有劑量依賴性，Pra-C濃度在40μmol/ml時與50ng/ml IFN-γ對A549細胞B7H3蛋白的下調作用無顯著差異（P=0.054）。

2.2 Pra-C可以下調A549細胞B7H3 mRNA的表達

Real-Time PCR結果顯示，40μmol/ml Pra-C組及50ng/ml IFN-γ組作用于A549細胞24h后均可顯著下調A549細胞B7H3 mRNA轉錄水平(分別是0.712±0.17，0.726±0.15，P=0.017,P=0.005)，且兩組之間無顯著差異，（t=-0.115，P=0.913）

2.3 Pra-C對B7H3-PGL3-promoter熒光報告基因的調節

熒光素酶實驗結果顯示不同處理組B7H3相對熒光強度：40μmol/ml 與IFN-γ組均可顯著下調A549細胞B7H3啟動子轉 錄（ 分 別 是 0.236±0.15，0.257±0.002，P＜0.001）， 且Pra-C與INF-γ對B7H3的調節作用無顯著差異（t=-2.628，P=0.054）。

3.討論

肺癌是當今全世界發生率和死亡率最高的惡性腫瘤。由APC細胞表面的多種共刺激分子與T細胞表面的相應受體結合，可以決定接受抗原刺激的T細胞是活化增殖，還是抑制甚至凋亡。B7H3作為重要的抑制性共刺激分子，其高表達抑制了T細胞對腫瘤細胞的免疫活性，造成腫瘤細胞的免疫逃逸，可成為肺癌治療的靶點。

已有研究顯示，50ng/ml IFN-γ可下調人肺癌細胞A549表面B7H3的表達。本研究用流式細胞學技術、RT-PCR技術、雙熒光素酶法分別檢測B7H3蛋白表達水平、轉錄水平及啟動子區的調節水平。結果顯示，當Pra-C濃度為40μmol/ml時下調作用最強，較50ng/ml IFN-γ無統計學差異。

Pra-C是前胡重要的香豆素類化合物提取物之一。前胡作為呼吸疾病常用藥物，具有降氣化痰、疏散風熱之功，探討Pra-C通過免疫調節作用發揮抗腫瘤療效對拓展中草藥前胡在抗腫瘤領域的思路有一定價值。

[1]劉一誠，戴彭辰，李慧英，騰柱國，何成詩.共刺激因子B7H3在非小細胞肺癌中的表達研究.現代生物醫學進展，2016,16(27):5309-531.

[2]趙建強，孫玉萍，王薇，等.B7H3分子在非小細胞肺癌中表達的研究.中國全科醫學，2008,11(1A):31-34.