CAR-T療法在血液病中的臨床應用研究進展

杜 俊，胡 靖，黃走方 (中國醫學科學院北京協和醫學院血液學研究所血液病醫院,天津300020)

0 引言

2010年,一位名叫Emily的美國小女孩,患有急性淋巴細胞白血病(acute lymphoid leukemia,ALL),經過2療程化療后疾病仍在治療3月后復發。鑒于相關毒副反應,Emily的父母拒絕了醫師建議的骨髓移植治療。Emily又經歷了1療程加強化療,仍未獲得緩解。她父母自愿參加了Pennsylvania大學的一項CART-19的臨床研究。幸運的是,CART-19的治療使她的疾病獲得完全緩解,該患者健存至今。但值得一提的是,Emily經歷了78%使用CART-19治療的患者皆會面臨的細胞因子釋放綜合征(cytokine releases syndrome,CRS),并伴有白介素-6(interleukin-6,IL-6)的爆發性增高,但經過托珠單抗(tocilizumab)特異性治療,她奇跡般獲得治愈。諾華公司立即投入119 億美元開展進一步研究［1－2］。

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cells,CAR-T)是一種新型細胞免疫治療方法,其通過基因編輯技術,將針對特定靶點的嵌合抗原受體以及共刺激分子引入T細胞之中,從而在非主要組織相容性抗體(major histocompatibility complex,MHC)依賴的條件下結合表達靶抗原的腫瘤細胞,通過共刺激分子激活T細胞進行殺傷。CAR-T細胞能夠靶向識別惡性腫瘤細胞抗原,將能夠識別該抗原的結構通過基因工程技術的手段使其在患者T細胞的表面,進而特異性地識別惡性腫瘤細胞,最終將其殺滅。

CAR由融合基因表達,該融合基因編碼單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)作為靶向結構域,通過間隔區和跨膜序列與信號傳導模塊連接。常通過逆轉錄病毒或慢病毒轉導將CAR轉基因隨機引入細胞基因組中,并從構建體中的病毒或哺乳動物啟動子轉錄。在臨床前研究中已經實現CAR靶向整合到內源啟動子元件控制下的明確基因組位點,并且可以提供更均質的CAR表達以提高治療效果。通常,非特異性的T細胞在用促有絲分裂抗體激活后被轉導,并且在再輸注之前在IL-2中單獨或與其他g鏈細胞因子短暫擴增。因為T細胞由CD4和CD8亞群組成,每個亞群又細分為純真T(TN)、中樞和效應記憶(TCM/TEM)、組織駐留記憶和效應細胞亞群,這導致CAR細胞產品具有極大的異質性。通過基因編輯技術開發的CAR-T細胞產品可跨越MHC屏障,但也常因殘存的TCR+細胞發生移植物抗宿主病(graftversus-host disease,GVHD),頗為棘手［3］。

CAR-T細胞治療本身即是個體化治療血液腫瘤的體現,在分子生物學發展日新月異的今天,深入研發CAR-T技術是精準治療血液病的重要探索方向。

1 治療疾病領域

1.1 復發難治B細胞淋巴瘤/白血病

1.1.1 復發難治B細胞淋巴瘤 Neelapu等［4］開展的ZUMA-1臨床試驗及Schuster的小規模試驗均顯示出CD19 CAR-T顯著的有效性。Neelapu納入的101例復發難治B細胞淋巴瘤,其中54%獲得完全緩解；而在Schuster等［5］的試驗中,28例患者中57%病情完全緩解。CAR-T療法在B細胞淋巴瘤中的療效好,但其療效持續時間有待進一步觀察。

1.1.2 中樞神經系統彌漫大B細胞淋巴瘤（central nervous system-diffuse large B cell lymphoma，CNS-DLBCL） Abramson 等［6］報道了 CD19 CAR-T 治療CNS-DLBCL的有效性。該患者為68歲女性,診斷為DLBCL(GC型 伴有BCL-2基因重排及MYC、BCL-6復制),經過5個療程DA-EPOCH-R方案化療,并接受了全相合的無關供者異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT),仍未治愈。CD19 CAR-T的治療使該患者獲得完全緩解,取得顯著療效。研究人員進一步在患者腦脊液中檢驗出CD19 CAR-T細胞的存在,也證明CAR-T細胞可通過血腦屏障發揮其治療作用。

1.1.3 復發難治B細胞急性淋巴細胞白血?。˙-ALL）Memorial Sloan Kettering癌癥中心的一項隨訪研究［7］顯示：CART-19在復發難治B-ALL中療效明顯。該隊列研究納入53名受試者,均為復發難治B-ALL患者。在這組患者中,完全緩解率為83%,中位生存時間為12.9月。分層研究顯示,治療前疾病負擔是生存時間及緩解率的有效預測因子。腫瘤負荷低的患者,其無事件生存率(event free survival,EFS)及總生存率(overall survival,OS)均顯著高于腫瘤負荷高的患者。

有研究［8］將CART-19療法應用于30例復發/難治B-ALL患者,27例(90%)獲完全緩解。隨訪6月,其EFS為67%,OS為78%。隨訪24月,仍有19例患者處于疾病緩解狀態。但即使CART-19療法存在頗高的近期臨床緩解率,若無法及時橋接造血干細胞移植,其長期緩解率仍不如人意。

國內燕達陸道培醫院亦有相應嘗試。該中心納入52例B-ALL患者,其中42例為復發/難治患者,經輸注劑量為1×105cells/kg的CART-19治療后,36例(90%)獲得完全緩解。中位隨訪230天發現,82.5%的患者橋接造血干細胞移植未出現疾病復發。根據該中心經驗,減低劑量的CAR-T治療可能縮減了CRS的發生率,同時減少了造血干細胞移植后復發率［9］。

1.2 難治性慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia， CLL）Porter等［10］將 CAR-T 技術用于治療難治性CLL。該患者為男性,1996年診斷CLLⅠ期,疾病觀察6年后患者因淋巴細胞增多及淋巴結腫大接受2療程利妥昔單抗+氟達拉濱治療,獲得疾病完全緩解。2006年患者因疾病進展再次使用4療程利妥昔單抗+氟達拉濱治療,同樣獲得完全緩解。2009年,患者疾病迅速進展,淋巴細胞增多及淋巴結增大明顯,分子生物學檢測發現TP53基因突變、17p染色體缺失,預后不良?；颊咴俅谓邮?療程利妥昔單抗+苯達莫司汀,以及3療程苯達莫司汀治療,疾病未緩解。Porter使用 CD19聯合 CD137 CAR-T細胞治療,采用1.5×105/m2的低劑量輸注,而在體內擴增達1000倍,疾病終獲完全緩解,隨訪10月未發現疾病復發進展跡象。同樣納入該試驗的另2例患者,亦獲得疾病完全緩解。CAR-T細胞治療在CLL領域不失為有益的嘗試。

1.3 多發性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）雖然CD19并非常規表達于漿細胞表面,但CD19 CART細胞療法治療MM頗具前景。Garfall等［11］報道的10例患者中,有2例在使用CTL019后,疾病緩解,無進展生存期(progression free survival,PFS)延長。另外,Ramos等［12］將 κ.CAR-T 治療 MM,4/7獲得疾病緩解,病情穩定,該反應甚至優于NHL及CLL。雖然CD138高表達于漿細胞表面,初步試驗卻顯示CD138 CAR-T療效不佳。 Guo等［13］將 CD138 CAR-T用于治療5例MM患者,也僅有3例病情穩定(stable disease,SD),表明目前的CD138 CAR-T治療MM尚無滿意療效。B細胞成熟抗原(B cell maturation antigen,BCMA)CAR-T治療MM是新的嘗試,Ali等［14］報道9例使用BCMA-CART的患者,1例獲得sCR(嚴格意義上的完全緩解),2例獲得VGPR(非常好的部分緩解),相關臨床試驗正進一步開展。嘗試新靶點的CAR-T細胞療法正成為治療MM的新手段,療效突出。而CAR-T聯合傳統化療、免疫化療或造血干細胞移植,有望使MM患者獲得更好的臨床緩解,甚至治愈。

1.4 T細胞淋巴瘤將CAR-T技術用于T細胞淋巴瘤技術難度頗大,因為治療靶向的抗原也常表達于正常T細胞表面。通過CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向CD7的CAR-T技術嘗試用于T細胞淋巴瘤,在臨床前期研究中顯示有效,可發揮抗腫瘤效應［15］。Maciocia等［16］進一步研發出可特異性結合TCRBC1的scFv,這使得CAR-T技術可靶向T細胞亞群而非整個T細胞結構域,這將帶來T細胞淋巴瘤治療的新突破。

1.5 急性髓系白血病（acute myelogenous leukemia，AML）AML較ALL更為常見,且年齡大于60歲的患者對化療反應差。CAR-T技術治療ALL的顯著療效,啟示臨床醫師將該技術應用于AML。目前,Lewis Y抗原(LeY)、CD33、CD123及CLL1均作為CAR-T治療AML的靶點用于臨床試驗,但遺憾的是,這些抗原亦表達于正常造血前體細胞,且AML的免疫表型異質性限制了這些靶點的功效［17］。靶向LeY的CAR-T治療收效甚微,而靶向CD123的臨床試驗正在開展。整合scFvs的CAR-T靶向HLA-A2/WT1正處于研發狀態［18］。但CAR-T技術治療AML的靶點應共表達于AML的表面分子,否則臨床有效性將受到限制。

2 主要不良事件

2.1 CRSCRS是CAR-T體內激活和殺傷腫瘤細胞過程中釋放大量炎癥因子導致一系列臨床表現的綜合征。CRS的發生頗為常見,臨床癥狀常包括發熱、低氧血癥、低血壓。在ZUMA-1試驗中,CRS發生率為 93%；而在 Schuster的試驗中,其發生率為57%［5］。由于CAR-T對不同腫瘤作用靶點的差異,CRS的出現時間和強度均有所不同,臨床預測模型及治療手段均為基于大型醫療中心的經驗,相關指南和規范仍在研究中。

2.2 神經系統毒副反應神經系統毒副反應常見為腦病、昏迷及震顫。ZUMA-1試驗中,其發生率為64%；而在Schuster的試驗中,其發生率為39%［5］。T細胞的直接毒性或釋放的細胞因子可能為其發病機制。遺憾的是,目前尚未找到合適的神經系統毒副反應預測因子。Abramson等將CART-19治療中樞DLBCL,發現CART-19細胞可穿透血腦屏障［6］。因此,CART-19 T細胞可能直接損害顱內臟器,有待進一步研究［3－4］。

2.3 感染風險驟然增加Budde等［19］觀察到,在CAR-T細胞輸注的前28天內,患者感染的發生率高達21%。結合Hay等的研究,Budde等總結其發生機制為循環血液中血管生成素-2和VWF因子造成內皮細胞損傷,使得病原微生物更易侵襲人體。在免疫調節功能紊亂的惡性血液病患者中,該侵襲功能進一步增強,從而使得CAR-T療法治療的患者感染率上升。因此,治療前充分評估患者感染風險是十分必要的。相關研究數據仍然偏少,尚需進一步總結經驗。

2.4 治療相關死亡率ZUMA-1試驗中,治療相關死亡率為3.0%；而在Schuster的臨床試驗中,治療相關死亡率為3.6%。該死亡率并不低,但考慮到難治性B-ALL疾病本身的死亡率,亦在接受范圍。但減低劑量及支持治療,包括毒副反應的控制仍至關重要［5］。

2.5 脫靶效應CAR-T細胞并非總能與腫瘤抗原特異性結合,當其與正常細胞組織表達的腫瘤相關抗原結合后,可對正常組織產生毒性反應,謂之脫靶效應。預防脫靶效應,可采取如下方法：①降低單次CAR-T細胞治療量；②應用抗體封閉正常組織上的腫瘤相關抗原；③構建自凋亡基因系統。

Ruella等［20］近期報道1例因脫靶效應致嚴重不良事件的案例。研究者在給一名復發/難治性B-ALL的患者制備CAR-T細胞時,因為脫靶,CAR意外地被加到患者癌變的B細胞上,形成了“CAR-癌細胞”。更意外的是,加到癌細胞上的CAR與癌細胞表面的CD19結合,使CAR-T細胞失去了識別癌細胞的靶標。該患者在接受CAR-T治療的261天之后,由于“CAR-癌細胞”大量增殖,癌癥復發,最終死于白血病相關并發癥。

3 討論與結語

盡管CAR-T療法有著較高的治療有效性,但半數患者無法獲得長期緩解,疾病復發率高,這也使其臨床應用受限。研究人員亦采用不同靶點或多靶點聯合的CAR-T療法,如CD22等,可避免腫瘤逃逸,增強CART療法的有效性。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術,在動物模型中CAR-T的抗腫瘤效應得以增強［21］。聯合作用于不同信號通路的藥物臨床研究也在開展,并顯示BTK抑制劑及PD-1抑制劑可能增強CAR-T療法的治療作用。但這些藥物的潛在不良反應尚未完全揭曉,多靶點聯合用藥有可能進一步增加不良反應事件發生率［22］。

第一代CAR-T細胞治療局限于單一T細胞靶向效應,植入率較低,故而臨床治療有效率偏低。而第二代(甚至三、四代)CAR-T細胞治療則部分克服了這種缺陷,因其為多靶點聯合治療,其中CD28及CD4-1BB常為共刺激域,這對CAR-T細胞的存活與增殖 是 有 益 的［23－25］。 聯 合 雙 靶 點 CD19/CD20、CD19/CD123、CD19/CD22的CAR-T技術正在研發,臨床試驗初見成效［26－28］。

上述特異性的CAR-T細胞產品制備價格昂貴,工序復雜,探索“通用型”CAR-T細胞技術也是具有潛力的研究方向。如果有更佳的手段克服MHC屏障,那么“通用型”T細胞可能較自體T細胞發揮更好的療效。源自健康供體的通用型CAR-T細胞具有克服與腫瘤治療相關的免疫缺陷的潛力。此外,通用CAR-T細胞產品可簡化工程細胞制造程序,甚至允許規?；a。與患者自體特異性T細胞相比,或可取得快速及高性價比的療效。然而,目前CAR-T細胞是否能單用發揮療效,結論尚未知。迄今為止,CAR-T療法常橋接造血干細胞移植治療。是否將CAR-T療法作為血液腫瘤常規治療整體策略的組成部分,需更多臨床數據證實。

CAR-T細胞療法作為新興治療手段,前景雖好,但仍處于探索階段。在倫理及法律程序上,亟待完善CAR-T細胞治療相關流程。其適用范圍、回輸時機、治療劑量、毒副反應及處理存在爭議,不宜作為一線治療,更不應盲目推廣。當化療、抗體治療或者造血干細胞移植后療效不佳的患者,可考慮CAR-T細胞治療。另外,將CAR-T療法用于治療實體腫瘤也有潛在的研究價值,這方面的探索正處于重大發現期［29］。