肺結核病相關miRNA的研究現狀

張倩 馮喜英 久太

一、肺結核的流行病學

肺結核病(tuberculosis)是通過呼吸道傳播的疾病，對人類健康及國民經濟造成巨大損失[1]，2015年全球結核病報告顯示，全球約有960萬新的肺結核病例[2]，中國仍是結核病高發國家之一，占全球總負擔的 15%[3-6]。肺結核主要好發于青壯年，而這部分人群是社會和家庭財富的主要創造者，青壯年患肺結核更容易導致家庭因病返貧、因病致貧，而且對社會經濟發展及其不利[7]，但至今為止尚仍沒有特異性適用于所有類型肺結核的快速診斷檢測方法。尋找快速準確的診斷方法仍是目前結核病診療的首要任務，同時也是防治結核病的重要環節[8-9]。

二、肺結核相關免疫學機制

當人體通過呼吸道感染結核分枝桿菌后，其大多數并不發病，其主要原因是人體的保護機制，發揮主要作用的是細胞免疫。T細胞在細胞免疫中起重要作用，巨噬細胞是主要的起始和效應細胞。T細胞可產生免疫調節劑，如干擾素γ(interferon gamma, IFN-γ) 、白細胞介素 (interleukin, IL) 12和淋巴毒素α。外周T細胞通過識別結核菌抗原刺激IFN-γ和腫瘤壞死因子α的產生來發揮作用[10]；當感染結核桿菌，自身的免疫系統將會開啟，釋放出巨噬細胞吞噬結核桿菌，可以使結核桿菌喪失其生存環境, 降低結核桿菌的活性，之后受感染的細胞及巨噬細胞進行自主凋亡過程, 清除機體受損[11]。然而，研究發現B細胞在抗結核中有重要的保護作用[12]。位于淋巴器官生發中心的B細胞通過很多方式發揮作用[13]：①它可以充當抗原呈遞細胞并影響T細胞的活化，從而在抗感染的防御中發揮作用;②可通過產生影響T輔助細胞反應的細胞因子在抗感染的防御中發揮作用；③B細胞可產生抗體，抗體通過調理作用、補體激活以及增強FcR介導的Mtb吞噬作用和殺傷作用來影響肺泡腔內感染，抗體并通過形成免疫復合物來清除免疫調節性Mtb抗原。綜上所述，B細胞在結核分枝桿菌感染時發揮作用。

三、miRNA概述

miRNA既為微小RNA，是近年來在許多真核細胞及病毒中發現的源自內源性染色體的非編碼單鏈調控RNA。miRNA在動物體內的炎癥反應和免疫機制中起著重要作用[14]，miRNA 可以調控許多生物學的過程，如細菌感染、細胞凋亡、細胞增殖、胚胎發育、細胞代謝、器官分化、信號通路等和多個生理和病理過程。近年來隨著對miRNA研究深入，結核病患者體內一些特異表達的miRNA越來越得到重視[15]。鑒于血清miRNAs具有檢測手段較簡便、易于收集、保存時間長等特點，且具備作為疾病分子生物標志物的優點，它很可能在肺結核的診斷和預后方面具有潛在的醫學價值。

1. miR-155: miR-155是目前公認的參與眾多生物過程的miRNA，例如感染、炎癥和免疫等[15]。研究表明結核分枝桿菌感染后miR-155的表達明顯升高，可作為肺結核診斷的潛在標志物[16]。研究表明在結核分枝桿菌感染后會引起細胞的自噬作用。自噬是一種防御和應激調控機制，細胞主要是通過自噬和溶酶體消除、降解和消化受損、變性、衰老成為失去功能的變性蛋白質、細胞器及其核酸等生物大分子。然而，自噬過多或過少均反過來危害細胞本身，自噬作用與自噬蛋白呈正相關(ATG1-ATG5)。研究發現，在被結核分枝桿菌感染的樹突狀細胞中，結核分枝桿菌誘導miRNA-155下調ATG3， 下調的miR-155與ATG3 mRNA的3′UTR區域相互作用，導致蛋白質水平降低，這將導致包漿型LC3(LC3I)轉化為自噬型LC3(LC3-Ⅱ)，導致自噬[17]。綜上miRNA-155在結核病的發病機制中起著重要的作用。

2. miR-144: 呂艷等[18]通過對比肺結核治療前后miR-144的變化水平，提示在活動性肺結核中miR-144呈現高表達，在治療好轉后miR-144呈下降趨勢。張立營等[19]通過研究活動期肺結核外周血中miR-144的表達水平與其血漿中的IL-6、TNF-α、IFN-γ水平的相關性，發現外周血miR-144的表達水平與IL-6、TNF-α、IFN-γ的濃度呈負相關，這與Liu等[20]提出的觀點不謀而合。Liu等[20]研究提出miR-144可以抑制TNF-α和IFN-γ的產生，由于TNF-α和IFN-γ在保護性免疫中具有重要作用，因此提示miR-144 可能通過調節T細胞產生細胞因子(TNF-α和IFN-γ)來調節結核分枝桿菌的免疫過程。此外他們還提出miR-144可通過作用于轉錄激活因子(Jak-STAT)信號傳導、Janus激酶/信號轉導、MAPK信號等傳導途徑的基因而發揮負調控作用。因此miR-144的表達水平極有可能影響結核病的發展和結局。

3. miR-29: 動物實驗及臨床試驗均表明在感染結核分枝桿菌后miR-29明顯升高[21-22]，miR-29主要通過下調IFN-γ來減弱機體對結核分枝桿菌的免疫應答。除靶向調控3'UTR IFN-γmRNA外，miR-29還可以促進IFN-γmRNA與Argonaute 2(Ago2)蛋白結合形成RNA誘導的沉默復合物，從而在轉錄中抑制IFN-γ的表達[23]。此外，研究表明，miR-29也可以靶向調節抗凋亡的p85α激酶和B細胞淋巴瘤2基因(Bcl-2)蛋白、GTPβ結合蛋白Cdc42以及髓樣細胞白血病-1基因(Mcl-1)蛋白[24-25]，這表明 miR-29在調節免疫細胞的凋亡途徑中起著關鍵的作用。 因此，結核分枝桿菌感染中miR-29的高表達可部分解釋結核分枝桿菌通過抑制IFN-γ和增加細胞凋亡以避免巨噬細胞吞噬的作用機制。有趣的是，在非致病的分枝桿菌感染模型中，miR-29表達下調。在NK細胞和T細胞中，牛分枝桿菌卡介苗可下調miR-29表達并誘導IFN-γ表達[26]。 綜上所述，miR-29表達升高可能抑制了T細胞的IFN-γ產生，并且miR-29的表達受到分枝桿菌菌種特異性毒力的影響。

4. miR-let-7: 早期研究表明，miR-let-7家族在機體對病原體的免疫應答反應中起著重要的調節作用。Kumar等[27]的研究結果顯示：結核分枝桿菌感染可顯著降低巨噬細胞中miR-let-7 的表達水平，而miR-let-7 的下調表達與結核分枝桿菌分泌的ESAT-6蛋白密切相關。A20(鋅脂蛋白A20基因)作為 miR-let-7的靶基因，是NF-κB通路的一種拮抗劑，結核分枝桿菌染后，巨噬細胞中miR-let-7的低表達上調了A20基因的表達，從而減弱NF-κB通路的活性。另外，該研究還指出，在缺乏A20的巨噬細胞中，結核分枝桿菌的生長速度減慢，而TNF、IL-1、亞硝酸鹽等細胞因子的合成是增強的；換言之，誘導巨噬細胞內miR-let-7的高表達會減弱結核分枝桿菌的生存力，進而增強細胞因子TNF、IL-1及亞硝酸鹽的合成。綜上所述，miR-let-7通過特異性靶向抑制A20基因的表達來增強NF-κB通路的活性，產生和釋放各種細胞因子，從而促進巨噬細胞凋亡并控制巨噬細胞內結核分枝桿菌的生長和繁殖速率。

5. miR-223: Dorhoi等[28]的研究表明，結核病患者的單核細胞中miR-223水平明顯上調，并指出 miR-223可以負向調節巨噬細胞的細胞因子產生。miR-223可通過轉錄后調控機制抑制中性粒細胞趨化因子如CXC趨化因子配體2(CXCL2)、趨化因子配體8(CXCL8)、CC趨化因子配體3(CCL3)和白細胞介素6等的表達，從而阻止大量中性粒細胞趨化至肺組織而導致的病理損傷，發揮對機體的保護作用。Cliff等[29]的研究表明miRNA-223的缺失導致嗜中性粒細胞浸潤減少并隨后加劇肺部炎癥，特別是在肺結核病理學過程中格外顯著，這也印證了miRNA-223的表達上調對肺結核感染時發揮的保護作用。Liu等[30]的研究提示：miR-223通過抑制單核細胞來源的巨噬細胞中的p65磷酸化和核移位來負性調節NF-κB的活化，從而抑制體內細胞因子的表達，并進一步抑制巨噬細胞的凋亡，從而抑制機體的抗結核免疫。綜上所述，肺結核感染中miR-223表達的上調在機體免疫中起著重要的保護作用。

6. miR-21: 相關研究表明：miR-21抑制炎癥細胞因子的表達并促進炎癥細胞因子IL-10的產生[31]。最近的研究發現，在被牛分枝桿菌感染后，無論在體外或體內，在未致敏的樹突狀細胞和巨噬細胞中均可通過TLR / Erk / NF-κB途徑上調miR-21的表達[32]。miR-21在早期結核分枝桿菌分泌的抗原性靶蛋白(相對分子量為6×103)抗原攻擊巨噬細胞后表達呈上調，在抗原呈遞細胞中降低miR-21活性，顯著促進機體抗分枝桿菌免疫的作用。miR-21還可通過直接靶向3′UTR IL-12 mRNA來抑制IL-12的表達，從而抑制宿主Th1的應答。此外，研究還發現miR-21在抑制結核分枝桿菌感染中，具有保護性細胞因子如TNF-α、IL-6基因的表達，但是這些細胞因子水平在ESAT-6暴露后并沒有顯著改變。有趣的是，miR-21也通過靶向調節Bcl-2促進樹突細胞凋亡，這也證實了以前的發現：既結核分枝桿菌可誘導被感染細胞凋亡，但miR-21可調控Bcl-2表達的機制尚不清楚。另外，miR-21通過誘導抑制IL-12的產生觸發更有效的抗分支桿菌應答。因此，miR-21可能是分枝桿菌可用于逃避宿主免疫應答并建立慢性感染的有效機制。

隨著研究的深入，大量科學證據表明miRNA參與結核病感染的進程，并在基因的表達調控機制中起著重要作用。 此外，研究發現血液，痰液和胸腔積液的特定miRNAs在區分結核感染和健康個體、活動性和潛伏性結核感染、結核和其他感染以及肺部疾病方面有重要意義，并且miRNAs具有易收集、穩定性好等優點，故miRNAs可作為結核桿菌感染的潛在診斷依據，以及作為評估結核病治療進程中的生物標志物。但目前miRNA的研究分析尚未覆蓋少數民族及不同海拔高度的人群。相信隨著對 miRNA 研究的不斷深入，對少數民族及不同海拔高度人群結核相關的miRNA發現；將會提出關于肺結核的更準確、更有臨床價值的特異性的miRNAs，并為結核病診斷與治療提供新的思路與策略，推動結核病診斷與治療的發展。