靈芝液體深層發(fā)酵的影響因素研究進(jìn)展

任 奕

（本溪化學(xué)工業(yè)學(xué)校，遼寧 本溪 117004）

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用的大型真菌，其孢子、菌絲和子實(shí)體均可被利用，具有祛病延年、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的作用。現(xiàn)代研究表明：靈芝多糖、靈芝三萜和靈芝酸是靈芝的主要生物活性，具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化等功效。近年來(lái)，采用液體發(fā)酵技術(shù)獲得靈芝有效成分的研究取得了較大進(jìn)展，但其發(fā)酵過(guò)程受多方面因素的影響。在靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基成分、發(fā)酵控制條件、補(bǔ)料方式、紫外線誘變和外源物質(zhì)添加等因素都會(huì)影響靈芝三萜類化合物、靈芝多糖和靈芝酸的產(chǎn)量。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于靈芝液體發(fā)酵影響方面進(jìn)行了大量的研究，在查閱收集大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，綜述近幾年靈芝液體發(fā)酵相關(guān)研究進(jìn)展，旨在為靈芝液體深層培養(yǎng)提供參考。

1 菌株篩選條件對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

湯坤鵬等為篩選靈芝液體深層發(fā)酵專用型菌株，以菌絲生物量、三萜、胞內(nèi)及胞外多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用灰色關(guān)聯(lián)度法綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：在24株靈芝菌株中，HS-2生物量最高達(dá)16.44 g／L；三萜含量以菌株 J-16／AL-14 最高（0.33%）；胞內(nèi)多糖以菌株 H（韓芝）含量最高（10.13%），胞外多糖以菌株 006（16.96 g／L）和 S-1（16.11g／L）最高。此外，靈芝菌絲檢測(cè)到靈芝酸 C 和 F。以權(quán)重分別為生物量 0.4、三萜 0.2、胞內(nèi)多糖0.2、胞外多糖0.2進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，菌株006與參考菌株關(guān)聯(lián)度最高，適合作為靈芝液體深層發(fā)酵菌株。該研究將灰色關(guān)聯(lián)度法應(yīng)用于靈芝液體深層發(fā)酵菌株篩選，對(duì)靈芝工業(yè)化液體發(fā)酵生產(chǎn)具有參考價(jià)值。

2 培養(yǎng)基成分對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

馮杰等以滬農(nóng)靈芝1號(hào)為供試菌株，以葡萄糖作為碳源，用硫酸銨、氯化銨、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨和酵母粉作為氮源，研究不同種類氮源對(duì)靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵過(guò)程的影響。首先，確定以N-10酵母自溶粉作為發(fā)酵的氮源，降低了發(fā)酵的復(fù)雜性和不確定性；其次，考察N-10酵母自溶粉不同濃度對(duì)靈芝菌絲體發(fā)酵合成靈芝三萜過(guò)程中菌絲體的生物量、葡萄糖消耗、靈芝三萜產(chǎn)量等的影響，確定以N-10酵母自溶粉的適宜添加濃度。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)，對(duì)4因素最佳水平范圍進(jìn)行研究，結(jié)果表明，葡萄糖、N-10酵母自溶粉、磷酸二氫鉀和七水硫酸鎂的含量分別為 31.06，2.76，1.77，1.99 g／L 時(shí)，靈芝三萜的理論產(chǎn)量為21.166 g／kg干菌絲體，實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)量提高到21.153 g／kg干菌絲體。與原工藝相比，新工藝的靈芝三萜產(chǎn)量提高了6.22%。

楊靜靜研究在靈芝液體深層發(fā)酵中，玉米粉對(duì)靈芝菌體形態(tài)和胞外多糖產(chǎn)量、相對(duì)分子質(zhì)量、單糖組成的影響。發(fā)酵過(guò)程中，隨著玉米粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，靈芝菌球直徑逐漸減小，中小型（S型和M型）菌球利于靈芝多糖生產(chǎn)；比較不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)玉米粉發(fā)酵獲得的多糖相對(duì)分子質(zhì)量及單糖組成。結(jié)果顯示，玉米粉對(duì)靈芝多糖的相對(duì)分子質(zhì)量沒有影響，但對(duì)靈芝多糖的單糖組成及其比例有很大影響，添加玉米粉發(fā)酵獲得的靈芝多糖中含有阿拉伯糖和木糖，但是巖藻糖和甘露糖的比例相對(duì)減少。

3 發(fā)酵控制條件對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

采用液體發(fā)酵法培養(yǎng)靈芝，控制因素較多，如溶氧、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量等。

3.1 溶氧控制條件的影響

孫金旭等以靈芝真菌為試材，研究在10 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)好氧型靈芝真菌條件下，溶氧控制條件對(duì)生產(chǎn)靈芝酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：溶氧對(duì)靈芝酸的影響較大，高通氣量有利于縮短發(fā)酵時(shí)間，適宜的通氣量為0.4 L／min，在此條件下，菌體和靈芝酸的最大產(chǎn)量分別為 8.27 g／L 和 171.26 mg／L；相對(duì)初始發(fā)酵條件，菌體和靈芝酸最大產(chǎn)量分別提高13.13%和13.28%；相對(duì)于低通氣量，菌體和靈芝酸達(dá)到最大產(chǎn)量的時(shí)間縮短12 h。

3.2 通氣量控制條件的影響

馮杰等采用5 L攪拌式發(fā)酵罐，研究靈芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵合成靈芝三萜的擴(kuò)大培養(yǎng)條件，考察不同條件下的通氣量對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)、比生長(zhǎng)速率、靈芝三萜合成、比合成速率、還原糖消耗、還原糖比消耗速率、銨根離子消耗、銨根離子比消耗速率的影響。研究結(jié)果表明，通氣量能夠顯著影響菌絲體的生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成，當(dāng)通氣量為8 L／min時(shí)，菌絲體合成靈芝三萜的得率和生產(chǎn)強(qiáng)度最高，分別為0.204 g／L 和 0.001 31 g／（L·h），最大菌絲體得率達(dá) 8.77 g／L。菌絲體最大比生長(zhǎng)速率為0.070 4 1／h，靈芝三萜最大比合成速率為0.025 61／h，還原糖和銨根離子最大比消耗速率分別為 0.562 1／h 和 0.017 11／h。

3.3 氧載體控制條件的影響

馮杰等以靈芝三萜濃度為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)正十二烷的添加量和添加時(shí)間進(jìn)行初步確定，再利用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵中的氧載體正十二烷的添加工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：在發(fā)酵的第 25.63 h， 加 29.85 mL／L 正十二烷的靈芝三萜濃度理論值為0.84 g／L；在500 mL搖瓶和5 L發(fā)酵罐中驗(yàn)證，得到靈芝三萜的濃度分別為 0.85 g／L 和 0.88 g／L，比對(duì)照組分別提高578%和398%。

3.4 變轉(zhuǎn)速策略調(diào)控條件的影響

趙娜等在研究靈芝發(fā)酵過(guò)程中，采用變轉(zhuǎn)速調(diào)控策略對(duì)振蕩發(fā)酵階段進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到高產(chǎn)三萜的目的。振蕩階段的最佳條件為：轉(zhuǎn)速由150 r／min變?yōu)?00 r／min。該策略與液體靜置培養(yǎng)相結(jié)合，菌絲體三萜產(chǎn)量高達(dá)678.0 g／L，比優(yōu)化前提高21%。

4 補(bǔ)料方式對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵體系中的生物量提高、底物利用、產(chǎn)物合成有一定的促進(jìn)作用。

馮杰等用50 L發(fā)酵罐進(jìn)行芝菌絲體液態(tài)深層發(fā)酵，比較4種補(bǔ)料培養(yǎng)方式對(duì)靈芝三萜合成的影響。結(jié)果表明，補(bǔ)料可明顯促進(jìn)靈芝菌絲體的生長(zhǎng)和靈芝三萜的合成；不同補(bǔ)料方式對(duì)菌絲體生長(zhǎng)和靈芝三萜合成有不同的影響；采用指數(shù)補(bǔ)料方式可獲得較高的菌絲體干質(zhì)量，提高靈芝三萜含量，比傳統(tǒng)發(fā)酵方式效果好；到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，靈芝菌絲體干質(zhì)量達(dá)到17.68 g／L， 靈芝三萜含量達(dá)到 4.58 g／100 g 干菌絲體，分別比分批發(fā)酵提高65.70%和100.88%。

5 紫外線誘變對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

紫外線是一種非電離照射，低劑量時(shí)通常不會(huì)殺死菌種，只能導(dǎo)致DNA突變，從而引起菌種生理特征和生物性狀變化。相比X-射線、γ-射線等電離輻射，紫外線易獲得，且對(duì)人體健康危害較小，在菌種誘變方面應(yīng)用廣泛。

張帥等采用紫外照射誘導(dǎo)菌種的方法增加靈芝菌絲體的多糖含量。首先，考察不同紫外照射時(shí)間和功率對(duì)靈芝菌絲體形態(tài)、生長(zhǎng)速度及多糖含量的影響，發(fā)現(xiàn)小功率、短時(shí)間的照射有利于菌絲體生長(zhǎng)，并可提高菌絲體多糖的含量，而大功率、長(zhǎng)時(shí)間的照射產(chǎn)生相反的影響。然后，通過(guò)正交試驗(yàn)確定紫外照射提高靈芝菌絲體多糖含量的最優(yōu)條件，即用20 W的紫外燈照射靈芝菌種10 min，靈芝菌絲體多糖含量可達(dá)9.57%，比未經(jīng)紫外照射的提高3.45%，但二者清除·OH和O2-·自由基的能力無(wú)明顯差異。

6 外源物質(zhì)添加對(duì)靈芝液體深層發(fā)酵的影響

在靈芝液體發(fā)酵過(guò)程中，選擇適當(dāng)?shù)耐庠次镔|(zhì)添加到發(fā)酵基質(zhì)中，使靈芝多糖、三萜類化合物產(chǎn)量增加。常用的外源物質(zhì)有中藥材、中藥提取物、脂肪酸、木質(zhì)素、油酸、茉莉酸甲酯、稀土元素和金屬元素等。

趙小瑞等采用振蕩-靜置兩段培養(yǎng)法，以當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪4種甘肅道地藥材提取物作為激發(fā)子，研究靈芝液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)靈芝三萜的變化。結(jié)果表明：在一定條件下，當(dāng)歸、黨參、甘草、黃芪提取物均能顯著促進(jìn)靈芝細(xì)胞生長(zhǎng)及靈芝三萜的產(chǎn)生，但四者的有效作用濃度范圍不同，當(dāng)歸、黨參醇提物質(zhì)量濃度為20～80 g／L時(shí)促進(jìn)作用良好，甘草、黃芪水提物在質(zhì)量濃度5～15 g／L時(shí)促進(jìn)作用良好。最佳添加時(shí)間分別為當(dāng)歸第2 d，黨參、甘草和黃芪均第3 d。發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)表明，4種中草藥提取物是有效的激發(fā)子，可促進(jìn)靈芝發(fā)酵三萜產(chǎn)量提高，當(dāng)歸添加量為 60 g／L 時(shí)，胞外三萜產(chǎn)量可達(dá) 964.63 mg／L。

姚強(qiáng)等研究硬脂酸、亞油酸和棕櫚酸對(duì)靈芝液體發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，3種供試脂肪酸都能促進(jìn)靈芝菌絲體生物量的積累；硬脂酸有利于靈芝胞外多糖的產(chǎn)生，在添加濃度為1.0 g／L時(shí)，胞外多糖量達(dá)到（1 066.74±11.27）mg／L，是對(duì)照的 3.37 倍；亞油酸利于胞內(nèi)多糖的合成，在濃度為1.5g／L時(shí)，胞內(nèi)多糖量達(dá)到（620.90±7.11）mg／L，是對(duì)照的 2.56 倍；另外，亞油酸還對(duì)靈芝胞內(nèi)三萜和胞外三萜量表現(xiàn)出較強(qiáng)的促進(jìn)作用，在濃度為2.0g／L時(shí)，胞內(nèi)及胞外三萜量分別達(dá)到（394.23±10.32）mg／L 和（551.32±6.22）mg／L，分別比對(duì)照提高1.13和1.12倍；而硬脂酸和棕櫚酸則降低胞內(nèi)和胞外三萜的量。