現階段結核抗體檢測在我國臨床應用的專家共識

《中國防癆雜志》編輯委員會

中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎學組和臨床學組

·專家共識·

現階段結核抗體檢測在我國臨床應用的專家共識

《中國防癆雜志》編輯委員會

中國醫療保健國際交流促進會結核病防治分會基礎學組和臨床學組

我國第四次和第五次全國結核病流行病學調查結果顯示，我國活動性肺結核患病率下降緩慢，但涂陽或培陽患者的比例下降顯著[1-2]。第五次全國結核病流行病學抽樣調查了252 940人，發現活動性肺結核患者1310例，其中涂陽患者188例，菌陽患者347例[1]，由此推測我國菌陰肺結核患者約占活動性肺結核患者的70%。根據2011—2016年出版的全球結核病報告，2010—2015年我國涂陽結核病患者的患病率分別為49%、44%、37%、35.5%、31.7%和31%，逐年降低[3-8]。菌陰結核病患者比例顯著增加已是我國結核病疫情的一個重要特點，給我國結核病防治工作帶來巨大挑戰。

結核病診斷除了依靠臨床癥狀、體征、影像學、病理學依據外，還有病原學診斷和免疫學診斷。病原學診斷(包括抗酸染色涂片鏡檢、結核分枝桿菌培養和分子生物學檢測)是活動性結核病確診的重要手段，但對菌陰肺結核難以發揮作用，免疫學診斷則是很好的補充。結核病免疫學診斷主要包括血清結核抗體檢測、結核變態反應原皮膚試驗和結核特異性γ干擾素體外檢測，三者均可輔助診斷結核病，特別是對菌陰結核病診斷的敏感度普遍高于病原學診斷[9-13]。其中，血清結核抗體檢測技術因具有較好的診斷特異度和敏感度，且操作簡單、檢測快速、實驗條件要求低、易于自動化等優點，曾作為我國結核病重要的輔助診斷方法[14-15]。然而，近些年血清結核抗體檢測面臨臨床不滿意、世界衛生組織(WHO)不推薦的尷尬局面。考慮到該方法作為活動性結核病的輔助診斷簡便易行，特別適合于基層結核病防治機構，筆者希望通過廣泛討論，形成現階段結核抗體檢測在我國臨床應用的專家共識，以期對血清結核抗體檢測尋找問題之所在、探索解決之辦法、指出研究之方向。

血清結核抗體檢測的臨床診斷價值與國內應用現狀

一、血清結核抗體檢測的臨床診斷價值

抗體是抗原誘導B淋巴細胞產生的具有免疫活性的免疫球蛋白(immunoglobulin，簡稱Ig)，其主要作用是與抗原發生免疫反應，阻斷病原體的致病作用。結核抗體陽性對活動性結核病具有輔助診斷價值，尤其是對于那些診斷困難的菌陰肺結核、兒童結核病或肺外結核(如脊柱結核)具有實用價值[14-16]。但極少數結核感染高危人群進行血清結核抗體檢測也呈陽性反應，在健康人群中血清結核抗體篩查的特異性優于γ干擾素釋放試驗(IGRA)[17]。結核病患者治愈后血清結核抗體可持續存在約12～15 個月[18]。

二、我國結核病血清學檢測試劑的研發現狀

血清學檢測是我國結核病輔助診斷的重要手段之一，市場上銷售的結核病血清學診斷試劑有近百家，截止到2017年11月20日，經國家食品藥品監督管理總局(CFDA)批準的國產診斷制品結核抗體檢測試劑盒30個、抗原檢測試劑盒3個，進口診斷制品結核抗體檢測試劑盒3個、抗原檢測試劑盒1個(http://www.cmde.org.cn/CL0039/)。通過收集到的各企業申請注冊時的臨床研究資料，顯示我國血液診斷試劑的敏感度平均在80%左右，高于70%者占79%；特異度平均值為92%，高于90%者占95%[19]；該結果與國內報道的多數結核抗體檢測研究結果接近。但臨床醫生卻普遍認為血清學診斷試劑的敏感度與特異度并不理想，其中，假陽性和假陰性問題是臨床醫生反映最強烈、也是最關注的問題。其中原因值得我們認真分析、追蹤并改善。

結核抗體檢測的影響因素和存在問題

總體上，大家認為結核抗體檢測的敏感度和特異度不穩定，不同研究報道的差異較大。近年來，國內外對結核抗體檢測呈現一片悲觀甚至全盤否定的態勢。事實確實如此嗎？筆者在廣泛征求專家意見和認真會商的基礎上，對影響結核抗體檢測發展的因素概述如下。

一、WHO對結核病血清學檢測的建議

WHO通過對94項商業化結核血清學檢測研究報告的評估(包括67項肺結核和27項肺外結核)，于2011年發布了《關于活動性結核病檢測手段的建議》(以下簡稱《建議》)。《建議》認為：與WHO推薦的檢測方法相比，結核血清學檢測產生大量假陽性或假陰性的錯誤結果[20]；血清結核抗體檢測的“敏感度低”，大量患者被漏診，呈假陰性；血清結核抗體檢測還顯示“低特異度”，大量患者被誤診，呈假陽性；WHO敦促各國采用推薦的準確的微生物或分子檢測方法，禁止使用不準確的和未經批準的血液檢測方法。

《建議》對我國結核病血清學診斷試劑的推廣應用產生較大影響。認真分析WHO發布的《建議》及相關研究，不難發現WHO評估中所用的標準并不適用于我國結核病疫情及防控，如果我們直接套用其結論將有失客觀。首先，WHO評估中對肺結核患者主要以痰液的結核分枝桿菌培養結果作為參考標準；對肺外結核患者以抗酸染色鏡檢、分枝桿菌培養或組織病理檢查作為參考標準[20]。由于臨床上菌陰結核病患者的診斷主要依據影像學檢查、臨床表現和診斷性治療效果觀察，因此，如果僅依靠WHO推薦的“準確的微生物或分子檢測方法”，臨床上可能會產生大量假陰性結果，造成大量菌陰結核病患者的漏診。其次，WHO對67項肺結核患者的評估結果表明：血清學檢測試劑的敏感度(0%～100%)和特異度(31%～100%)高度可變[20]，顯而易見敏感度為0%的試劑是“假試劑”，將假試劑與正常試劑不分“偽”與“劣”同時分析比較，不嚴謹也不科學，同時影響了分析結果的可信度。

二、診斷試劑的生產和質量控制對結核抗體檢測結果的影響

診斷試劑因其使用目的不同，對敏感度和特異度的要求不同。用于結核病初篩需要較高的敏感度，而用于結核病輔助診斷則需要較高的敏感度和特異度，然而追求高特異度往往會降低一部分敏感度，反之亦然。國內臨床使用單位在對國內診斷試劑的質量評估中發現，同一生產廠家不同批次產品進行臨床檢測的敏感度和特異度均存在明顯差異[21-23]。通常在獲得客戶單位準入前進行評估時具有較好的敏感度和特異度，而一旦準入后在日常使用中，敏感度或特異度均出現顯著下降。由于試劑盒生產的重要原材料(如抗原)的來源、純度、用量等對試劑盒的敏感度和特異度都會產生顯著影響，國內某些診斷試劑生產廠商采用外購抗原，在這種情況下如何保證主要原材料的質量和批次間的一致性至關重要。另外，批生產過程中保持工藝的一致性，特別在抗原配制用量方面需要保持一致。從目前臨床使用單位的評估結果來看，不能排除生產廠商根據使用對象或用途不同調整抗原用量的可能性。診斷試劑的生產廠家有責任和義務對試劑生產中原材料、生產工藝等進行嚴格的質量控制，使用單位應該對試劑盒進行定期評估后及批次性能驗證，及時向生產企業反饋評價結果；做好該項的室內質量控制工作。總之，全程的質量保證體系對于結核抗體檢測的臨床診斷價值至關重要。

三、抗原選擇對結核抗體檢測結果的影響

肝炎、艾滋病等病毒性疾病的血清學診斷通常具有很高的敏感度和特異度(95%以上)，但結核抗原和機體對結核分枝桿菌的免疫應答過程較復雜，以目前已發現的抗原和血清學診斷技術，結核抗體診斷要實現類似肝炎和艾滋病等抗體檢測的敏感度和特異度非常困難。

用于血清學檢測試劑的抗原存在很大差異，包括抗原組成、來源、化學構成(蛋白、碳水化合物、脂質等)、抗原的純度和純化方法等均對結核抗體檢測的敏感度與特異度產生影響，臨床上不同診斷試劑的診斷效果差異顯著[21-24]。早期用于血清學檢測的抗原主要是結核分枝桿菌純蛋白衍生物(PPD)及其他細菌粗提取物，但由于這些抗原與其他細菌抗原具有較多的交叉反應，故特異度較差。隨著分子生物學技術的提高，越來越多純化的特異性抗原、以及不同生長階段的特異抗原得到研究者的關注[25-27]，以期提高血清學檢測的效果和擴展血清學檢測的作用。由于結核病患者免疫功能不同導致對結核分枝桿菌抗原識別的差異，以及結核病患者對抗原的識別存在階段特異性，其抗體反應針對多種結核分枝桿菌抗原。因此，任何一個單一抗原的檢測試劑盒都無法檢測出所有結核病患者血清中的結核抗體，單一抗原的試劑盒逐步被多種抗原混合、融合或組合檢測的試劑盒所代替，以期提高臨床檢測的敏感度。

四、檢測技術對結核抗體檢測結果的影響

抗體檢測技術不斷在創新發展，新的免疫標記、放大檢測系統(如化學發光標記系統、液晶光學傳感器、磁珠微芯片、間接免疫PCR試驗等)的引入顯著提高了結核抗體檢測的敏感度，我國自主研發的選用5個結核抗原的化學發光法結核抗體診斷平臺已問世，但目前臨床上仍以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、酶聯免疫膠體金滲濾法(DIG-FA)、膠體金免疫層析法(GICA)、蛋白芯片技術為抗體檢測的主要技術。尤其是膠體金抗體檢測方法簡便、快速、無需特殊儀器而在臨床上廣泛應用；但其檢測結果的可靠性受到臨床質疑，其通過肉眼定性判斷，結果弱陽性時準確性較差。此外，不同試劑盒包被的抗原種類、抗原濃度、顯色液質量的穩定性、硝酸纖維膜的質量差異、膠體金的質量穩定性、包被工藝的差異、濾紙的吸水度好壞，甚至試紙條的寬窄等都可能導致試劑檢測質量的差異。檢測用二抗同樣有可能影響檢測效果，某些學者認為以新型抗體結合分子為靶標的酶標二抗的創新研發可能有助于提高結核抗體檢測的準確度[27]。如果以定量檢測產品代替膠體金技術的定性產品，并且應用于臨床，必將極大地提高結核抗體檢測的可靠性。

五、臨床評價的規范性不足對結核抗體檢測的影響

臨床使用單位一個普遍感受是，部分診斷試劑注冊時的臨床研究結果的敏感度與特異度優于其臨床實際使用的效果。原因何在？診斷制品臨床評價的基本原則是，被評估試劑的受試人群應與臨床實際使用人群相一致[28]。結核病血清學檢測的臨床定位應該是主要用于“菌陰肺結核和肺外結核”的輔助診斷，因此鑒別結核病患者與非結核的其他疾病患者應作為此類試劑臨床研究中的主要評估內容。臨床研究中，受試者入組應遵循如下原則：就診疑似結核病患者隨機入選，最終以臨床診斷為結核病患者結核抗體檢測的陽性檢出率判定試劑的敏感度，以臨床診斷為非結核的其他疾病的患者結核抗體檢測的陰性符合率判定試劑的特異度。按此要求入選人群的結核病患者與非結核病患者應符合一定的比例；健康志愿者的檢測結果可作為參考數據納入分析。但不少研究在特異度評估時，除選擇非結核呼吸疾病患者外，還有大量健康者入組，甚至以健康志愿者為主，需要評估特異度的非結核呼吸疾病患者很少、甚至缺乏，導致臨床研究中特異度虛高[29]。而對敏感度的評價，不少研究僅以菌陽患者為評價對象[29]，忽視了存在大量菌陰結核病患者的事實，造成敏感度虛高的結果。正是因為這些有意或無意的臨床設計，導致臨床研究時報告的血清結核抗體檢測的敏感度和特異度都非常好，引起人們對該類檢測試劑結果的誤讀，形成或提供了不充分甚至錯誤的信息[28]。

對結核病血清學抗體檢測的建議和展望

綜上分析，結核病血清學檢測的真實情況并不像WHO《建議》中所述的那么糟糕。參考我國已發表的數據，推測WHO在做結核病血清學檢測試劑時所采用的對照方法(病原學檢測)和參考標準(菌陽患者)與中國結核病疫情有較大出入。由于病原學檢測對菌陰結核病和肺外結核患者的診斷效能差，而我國菌陰結核病在結核病患者中占有相當大的比例，結核病血清學抗體檢測依然是結核病診斷的一個重要輔助手段，臨床上主要用于菌陰肺結核和肺外結核的輔助診斷。對我國結核抗體檢測的真實情況應客觀分析、理性采納，對該方法存在的問題應深入研究、探尋解決問題的途徑，而不是武斷地全面否定結核抗體檢測技術。

一、對檢測用抗原進行篩選或優化

合適的抗原或抗原組合是血清學檢測的關鍵，應用客觀準確的評價體系尋找和發現具有明確診斷價值的抗原是個重要的研究方向[27,30-31]。不同抗原組合對不同人群或不同疾病狀態有不同的敏感度和特異度，尋找敏感度和特異度較高、穩定性較好且具有互補性的抗原組合，有可能提高檢測試劑的敏感度和特異度，也可為菌陰肺結核和肺外結核患者的輔助診斷提供重要依據。

二、加強結核抗體檢測產品的質量保證

對結核抗體檢測產品應該從研發、生產、檢測、應用等多方面提高血清學檢測的敏感度、特異度及其穩定性，特別是生產企業應嚴格按照良好的生產規范[藥品生產質量管理規范(GMP)]組織生產。結核抗體檢測產品的生產企業應嚴格按照批準的生產工藝進行生產，對原材料選擇、抗原純度和用量等實施嚴格的質量控制；對產品的質量控制應統一和規范評價指標，以提高結核抗體檢測產品的穩定性、減少產品批次間的質量差異；保證提供給臨床單位日常使用的產品與注冊申報和市場招標時產品工藝和質量的一致性，確保不同時間生產的同一產品具有一致的診斷效果，確保其對菌陰肺結核和肺外結核患者的輔助診斷作用。

三、建立科學的評價體系

從一定程度上，臨床評價的不規范、不嚴謹是目前結核抗體檢測結果的不精確性和不一致性的原因之一[22,27,29]。首先，研發階段對結核抗體檢測試劑的臨床評價，應根據試劑的檢測目的納入不同感染類型、不同免疫狀態、不同病程等的患者[27,29]。其次，對已獲批上市的結核抗體檢測試劑在臨床應用過程中的質量控制應有統一標準，對上市后產品應進行獨立的第三方評價。用于評價的血清應包括使用經過標準化及嚴格質量控制的低、中、高等不同效價梯度的陽性血清和陰性血清，必要時對不同廠家、不同制劑的試劑盒進行系統的比對和評價，評價過程也應嚴格按照事先制定的標準操作方法進行。另外，使用單位在選擇產品前和使用過程中可對不同廠家的診斷試劑進行科學評估，選擇質量穩定的產品應用于臨床診斷。

四、臨床使用時作為輔助診斷試劑與其他檢測手段聯合使用

血清學檢測方法主要用于臨床上菌陰肺結核和肺外結核患者的輔助診斷，雖然與結核菌素皮膚試驗(TST)及IGRA同樣不能作為診斷結核病的金標準，但其對菌陰肺結核和肺外結核患者的診斷可能具有較好的敏感度，與其他檢測方法適當聯用有望提高菌陰肺結核和肺外結核的輔助診斷價值。

五、加強結核抗體檢測對菌陰肺結核患者和結核潛伏感染者的研究

目前研究顯示，MTB潛伏感染者的結核抗體水平顯著低于活動性結核病患者[32-33]，抗體水平增高是MTB活動感染的標志。根據有關文獻，在菌陰肺結核的診斷中，血清結核抗體陽性也是其診斷標準之一[34-35]。因此，結核抗體檢測最大的優點是可以對菌陰肺結核和肺外結核進行輔助診斷，以及可能對結核潛伏感染者進行鑒別診斷。然而，關于結核抗體對結核潛伏感染者的鑒別診斷，迄今為止，國內外均缺乏這方面系統、科學、大規模的臨床研究。結核抗體檢測的最大特點是已有成熟、敏感、簡便易行的檢測技術(如ELISA)，越來越多的優異抗原被開發；特別是我國存在大量的菌陰肺結核和肺外結核患者，如果通過了大量、科學、客觀的研究，結核抗體檢測能對這部分人群的診斷和篩查有所突破，對我國結核病控制將具有重要意義。

參與討論與撰寫本共識的主要單位和專家(排名不分先后)：102629 北京，中國食品藥品檢定研究院(徐苗、王國治)；100091 北京，解放軍第三〇九醫院 全軍結核病研究所(吳雪瓊、梁建琴、安慧茹)；200433，同濟大學附屬上海市肺科醫院結核病臨床研究中心(肖和平、范琳)；101149 北京市胸科醫院(逄宇、張宗德、李自慧)；102206 北京，中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心(趙雁林)；100710 北京，中國防癆協會秘書處(成詩明)；100095 北京，北京老年醫院檢驗科(劉佳文)；100050 北京結核病控制研究所(王甦民)；510095 廣州市胸科醫院檢驗科(譚耀駒)；450016 鄭州，河南省疾病預防控制中心結核病參比實驗室(李輝)；201508上海市公共衛生臨床中心(范小勇)；410013 長沙，湖南省胸科醫院 湖南省結核病防治所檢驗科(譚云洪)；710061 西安市結核病胸部腫瘤醫院(黨麗云)；300011天津市結核病控制中心結核參比實驗室(王春花)；150500哈爾濱，黑龍江省傳染病防治院 結核病實驗室(侯艷杰)；110044 沈陽市胸科醫院中西醫結合病房(梁秋)； 400020 重慶市肺科醫院結核基因診斷中心(鐘敏)

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10.3969/j.issn.1000-6621.2018.01.004

吳雪瓊，Email：xueqiongwu@139.com；徐苗，Email：xumiaobj@126.com

2017-12-01)

薛愛華)