GeneXpert MTB/RIF檢測內科胸腔鏡活檢組織研磨懸液診斷結核性胸膜炎的價值

李成俊 孫炳奇 孫嬌 張威 王洋 吉利 馬方

結核性胸膜炎是造成胸腔積液的主要病因，在結核病高流行地區，約50%的胸腔積液由結核性胸膜炎引起[1-2]。由于結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是導致結核性胸膜炎的直接原因，因此直接的病原學證據是診斷結核性胸膜炎的金標準。但是我國結核性胸膜炎患者胸腔積液中分離到抗酸桿菌的陽性率不足5%，MTB培養[包括BACTEC MGIT 960分枝桿菌液體培養(簡稱“MGIT 960培養”)和羅氏固體培養]的陽性率也僅為10%～20%，且培養時間需要4～8周，不利于臨床及時診斷和治療[3]。

新型核酸擴增分子檢測方法——GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)全自動檢測系統以全自動半巢式實時PCR技術為基礎，以rpoB基因為靶基因，可在2 h內同時檢測MTB和對利福平是否耐藥[4]，該方法于2010年由WHO推薦用于肺結核的診斷[5]，2013年WHO又推薦其用于肺外結核的診斷[6]。但是近期有文獻報道，胸腔積液中Xpert檢測MTB的陽性率僅為12.5%～15.4%[3, 7]，因此，依靠胸腔積液Xpert 檢測確診結核性胸膜炎不能滿足臨床需要。本研究采用內科胸腔鏡直視下胸膜活檢組織標本研磨后的懸液行Xpert檢測，試圖評價該方法在結核性胸膜炎診斷中的應用價值。

資料和方法

一、研究對象的選擇

1. 研究對象：收集2017年1月1日至12月31日在沈陽市胸科醫院胸膜炎病房住院的行內科胸腔鏡檢查的不明原因胸腔積液患者51例。其中男27例，女24例；年齡19～65歲，平均(35.2±14.1)歲。51例患者入組標準為彩色超聲檢查顯示單側或雙側胸腔積液，積液深度>3 cm，未經過抗結核藥物治療，未進行胸腔穿刺術，一般狀態可耐受內科胸腔鏡操作，HIV檢測陰性。所有患者臨床資料完整，檢查前均簽署知情同意書。

2. 結核性胸膜炎診斷標準： 以胸腔積液或胸膜活檢標本通過涂片或培養找到MTB作為結核性胸膜炎病原學確診標準，以胸腔組織標本病理檢查找到干酪性肉芽腫及抗酸染色陽性作為結核性胸膜炎病理學確診標準[8]；以胸膜組織病理學檢查明確為惡性腫瘤作為惡性胸腔積液診斷標準。

二、方法

1. 主要設備：可彎曲式電子胸腔鏡(型號LTF-240，日本Olympus公司)、胸腔鏡專用一次性軟性套管、活檢鉗、胸腔閉式引流瓶等。

2. 檢查方法：彩色超聲定位確定手術切口，常規消毒、鋪巾后，以5 ml 2%的利多卡因注射液沿肋間逐層浸潤麻醉至胸膜，沿肋間切開約1.0 cm長的切口，用止血鉗分離皮下組織至胸膜腔，將胸腔鏡套管從切口垂直插入胸腔直至有突破感后，拔出針芯，將電子胸腔鏡沿套管送入胸腔，掃視胸膜腔，手控負壓(胸腔鏡自帶負壓吸引功能)吸出胸腔積液，觀察臟、壁層胸膜表面情況，攝取照片保存；同時在壁層胸膜多點取病灶組織送結核病實驗室和病理科檢查以協助診斷，操作結束后放置閉式引流管至恰當位置，觀察有無出血，縫合切口。

3. 標本處理：所有患者胸膜活檢組織標本均分為兩部分，一部分進行病理檢查：以4%甲醛固定，石蠟包埋，切片進行抗酸染色及蘇木精-伊紅染色；另一部分進行MTB病原學檢查：將直徑為6 mm的無菌陶瓷珠放入2 ml的美國MP FastPrep-24 樣品處理系統樣品管中，再將切碎后的標本加入樣品管，隨后加入0.5～1.0 ml的0.9%氯化鈉注射液，擰緊蓋子后將樣品管安裝到MP FastPrep-24MP均質破碎儀上(美國MP Biomedicals公司)，按組織的堅韌度等調節設置按鈕，采用頻率為6.5 m/s，設置時間標準為20 s，一般組織振蕩2～3次即可。制成的懸液分別進行MGIT 960培養及 Xpert 法檢測。

4. Xpert檢測[9]：取1 ml按上述方法處理完畢的標本放置于有螺旋蓋的標本前處理管中，加入2 ml 標本緩沖液，旋緊蓋子在旋渦振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使標本充分液化。吸取2 ml液化的標本至Xpert 反應試劑盒，置于Xpert檢測系統(美國Cepheid公司)模塊，儀器開始自動化檢測。約2 h反應結束后，在檢測系統窗口下可直接觀察測試結果。Xpert用5條分子信標探針將81 bp的利福平耐藥核心區間(RRDR)以全部覆蓋的方法進行檢測，第6條探針作內對照。當樣品中不存在MTB時，分子信標探針無法與目標序列配對結合，分子信標仍然呈莖環結構，5條探針均無熒光釋放，而只有作為內對照的探針被檢測出來，結果判為MTB陰性。當樣品中存在對利福平敏感的MTB時，5條分子信標探針特異性地與目標靶序列配對結合且均釋放熒光，結果判定為MTB陽性，且無利福平耐藥。當樣品中存在對利福平耐藥的MTB時，目標靶序列上某個位點產生突變，5條分子信標探針中的1條或者幾條不能很好地與之結合，儀器檢出少于5條探針，結果認為MTB為陽性且對利福平耐藥。

5. MGIT 960培養(美國BD公司)：取2 ml處理后的標本用于培養，嚴格按照操作說明進行前處理，培養時間設定為42 d。儀器自動報告陽性后，取培養液涂片鏡檢，查到抗酸桿菌并經菌種鑒定，以確定為MTB作為陽性結果，未見抗酸桿菌為陰性結果。對陽性菌株進行利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，檢查耐藥情況。

三、統計學處理

采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計數資料采用“率(%)”表示，其中3種檢測方法陽性檢出率的一致性比較采用Kappa檢驗，Kappa值>0.75表示一致性較好，Kappa值<0.4表示一致性較差；3種檢測方法敏感度的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、不同檢查方法診斷結核性胸膜炎的陽性檢出率比較及患者確診情況

以MGIT 960培養陽性，且菌種鑒定為MTB作為病原學確診標準，20例患者確診為結核性胸膜炎，陽性檢出率為39.2%(20/51)；以胸膜組織活檢病理肉芽腫性病變并抗酸染色陽性作為病理學診斷標準，17例患者確診為結核性胸膜炎，陽性檢出率為33.3%(17/51)；51例患者中共有34例最終確診為結核性胸膜炎(MGIT 960培養與病理確診患者中有3例重疊)，其余17例診斷為非結核性胸腔積液，其中病理檢查證實惡性腫瘤13例，非特異性炎性胸腔積液4例。51例患者中22例 Xpert 檢測為陽性，陽性檢出率為43.1%(22/51)。MGIT 960培養和Xpert 法陽性檢出率比較，Kappa=0.76，兩者具有良好的一致性；但是MGIT 960培養與病理檢查陽性率比較，以及Xpert 法與病理檢查陽性率比較，Kappa值分別為0.31和0.11，說明兩種病原學檢查方法與病理檢查方法一致性均較差。

二、Xpert診斷結核性胸膜炎的價值

以最終診斷結果為金標準，Xpert 法檢測的敏感度和特異度分別為64.7%和100.0%，MGIT 960培養法檢測的敏感度和特異度分別為58.8%和100.0%，病理檢查的敏感度和特異度分別為50.0%和100.0%；Xpert 法檢測的敏感度高于MGIT 960培養法和病理診斷，但差異無統計學意義(χ2=1.53，P=0.466)。通過MGIT 960培養確診的20例患者中，18例Xpert檢測結果為陽性，通過病理檢查確診的17例患者中，6例Xpert檢測結果為陽性(3例重疊的患者中有2例Xpert檢測結果為陽性)。具體見表1。

三、耐藥情況檢測

MGIT 960培養陽性的患者中，5例患者的標本檢測出耐藥菌株，其中單耐鏈霉素1例、單耐利福平1例、耐異煙肼+利福平1例、耐異煙肼+鏈霉素1例、耐異煙肼+鏈霉素+乙胺丁醇1例，其中耐利福平共2例；Xpert檢測陽性患者中，2例對利福平耐藥，兩種檢測方法之間利福平耐藥患者無交叉。34例患者耐藥率為20.6%(7/34)。

注 敏感度(%)=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度(%)=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值(%)=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值(%)=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%

討 論

結核性胸膜炎是由于MTB感染，胸膜對MTB菌體成分產生遲發型變態反應而發生的炎癥，部分患者表現為咳嗽、發熱、胸痛甚至呼吸困難，以及出現少量至中等量胸腔積液，少數患者可出現大量胸腔積液。胸腔積液抗酸染色和培養發現MTB是診斷結核性胸膜炎的金標準，但是找到病原菌十分困難，其主要原因為[10]：(1)大多數情況下胸腔積液中不含有MTB，其產生是由于MTB的代謝產物或炎癥因子刺激所致；(2)即使有MTB進入胸腔積液中，因其含量低，積液量大，MTB被稀釋，現有方法學的局限性使其不易被檢出；(3)形成膿性胸腔積液，標本處理和質量控制困難，MTB不容易被檢測出來。即使是目前已經廣泛應用的Xpert技術，在胸腔積液中檢測到MTB DNA的陽性率也僅為12.5%～15.4%[3, 7]。因此，依靠胸腔積液細菌學陽性結果來診斷結核性胸膜炎是非常困難的。但是，如果患者不能得到早期的診斷和治療，對患者的預后會有很大影響。

一、Xpert技術在國內外的應用情況

Xpert 技術是由美國Cepheid公司研發的一套半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術。近年來的多項研究表明，Xpert法對肺結核的診斷價值較高，劉旭等[11]研究顯示，Xpert法對肺結核診斷的敏感度為90.4%(95%CI：89.2%～91.4%)，特異度為98.4%(95%CI：98.0%～98.7%)；王桂榮和黃海榮[12]應用Xpert 技術檢測骨關節結核部位的膿液標本，敏感度為82%，特異度為100%；Bahr等[13]應用Xpert法檢測腦脊液標本診斷結核性腦膜炎的敏感度達72.0%；陳禹等[9]報告Xpert檢測HIV陰性泌尿系結核患者尿液標本的敏感度為64.4%，特異度為100.0%。盡管Xpert檢測方法在痰、關節液、腦脊液和尿液標本中的敏感度非常高，但是Sehgal 等[14]對31項Xpert研究的Meta分析結果顯示，21項研究以培養陽性作為“金標準”，Xpert檢測對2167例結核性胸膜炎患者的匯總敏感度為51.4%；而10項研究以臨床綜合診斷為標準，Xpert檢測對937例結核性胸膜炎患者的匯總敏感度僅為22.7%，無論是“金標準”還是綜合診斷標準，其匯總特異度均在98%以上。因此，在現有的研究中，Xpert檢測在結核性胸膜炎中的診斷價值非常有限。但是，盡管Xpert檢測在結核性胸腔積液中的檢測陽性率相比其他標本低，但是特異度接近100%，因此，其陽性結果理應被視為具有診斷價值[15]。

二、內科胸腔鏡在不明原因胸腔積液診斷中的優勢與不足

內科胸腔鏡雖然是一種侵入性檢查，但具有創傷小、操作簡單、能夠在局部麻醉下完成、觀察視野清晰、安全有效等優點[16]。近年來在不明原因的胸腔積液診斷中越來越受到重視。Kong等[17]報道，經可視的內科胸腔鏡活檢，結核性胸膜炎的明確診斷率可達93.4%，Wang等[18]報道，833例不明原因胸腔積液患者應用內科胸腔鏡檢查，確診率達92.6%，Agarwal等[19]采用Meta分析，對17項研究、共計755例不明原因的滲出性胸腔積液患者進行匯總分析，內科胸腔鏡檢查診斷的敏感度和特異度分別為91%和100%。因此，內科胸腔鏡能在直視下進行診斷和治療，更能在直視下取得理想的活檢組織而獲得準確率更高的診斷，相比閉式胸膜活檢和胸腔積液的化驗檢查有更明顯的優勢。但是Amer 等[20]的研究報道，在確診的結核性胸膜炎患者中，通過內科胸腔鏡活檢組織行病理學檢查者只有53.8%表現為肉芽腫伴干酪樣壞死的結核典型病變，董宇杰等[7]也報道僅有41.7%的病理組織學表現為結核典型病變。《中國結核病病理學診斷專家共識》[21]中指出，組織標本HE染色具有結核病基本病理變化并抗酸染色陽性者，仍需要MTB基因檢測陽性方可確診結核病，如果MTB基因檢測結果為陰性，僅能提示性診斷結核病或者分枝桿菌病。近年來，基于核酸擴增技術的分子檢測方法在石蠟包埋標本中應用廣泛，但是MTB核酸熒光定量PCR法的檢測陽性率僅為30.5%，Xpert技術對石蠟包埋標本進行檢測則罕有報道[22]。因此，如何提高結核性胸膜炎的診斷準確率是一個亟待解決的問題。

三、內科胸腔鏡胸膜活檢組織研磨懸液進行Xpert檢查在結核性胸膜炎診斷中的價值

本研究結果顯示，胸膜活檢組織研磨懸液進行Xpert檢查的敏感度為64.7%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為58.6%，明顯高于文獻[3]和[7]報道的檢測陽性結果，證實此方法對提高結核性胸膜炎的診斷率有明確意義。在34例結核性胸膜炎確診患者中，Xpert法檢測陽性22例，MGIT 960培養法陽性20例，盡管兩種檢驗方法陽性檢出率一致性較好，且敏感度差異也無統計學意義，但是Xpert法僅需要2 h即可獲得檢驗結果，而MGIT 960培養則需要2～3周才能獲得檢驗結果，Xpert檢測較MGIT 960培養法具有明顯的時間優勢。最新的《WS 288—2017肺結核診斷》[23]中已將胸腔積液MTB核酸檢測陽性納入結核性胸膜炎的確診標準中。因此，胸膜活檢組織研磨懸液Xpert檢測陽性今后也可作為結核性胸膜炎的確診依據，協助診斷并指導治療。

四、初治結核性胸膜炎患者的耐藥情況分析

MGIT 960培養陽性的患者中，5例患者標本檢測出耐藥菌株， Xpert檢測陽性的患者標本中，2例對利福平耐藥，二者之間并無交叉，34例確診患者(均為初治)耐藥率為20.6%。耐藥順序為利福平(4例，包括MGIT 960培養2例，Xpert檢測2例)、異煙肼(3例)、鏈霉素(3例)、乙胺丁醇(1例)。兩種檢測方法耐藥結果無交叉，可能與本研究樣本數量較少、內科胸腔鏡多位點(3～6個點)取材及取材樣本量相對較少等有關。黃慶紅等[24]報道265例結核性胸膜炎患者以痰標本和胸腔積液標本進行細菌耐藥檢測，在初治結核性胸膜炎患者中耐藥率為30.1%，本研究結果低于上述報道，分析可能的原因為：(1)樣本量較小；(2)排除了痰標本的耐藥結果。因此，關于初治結核性胸膜炎患者耐藥情況今后還有待于收集更多的臨床資料進一步確證。

五、3種檢測方法的比較

本研究所有患者經內科胸腔鏡活檢組織研磨懸液均同時做了2種病原學檢測和活檢組織病理學檢查，3種方法在敏感度方面的差異沒有統計學意義，在臨床應用方面各有利弊：MGIT 960培養費用較低，可做多種藥物的藥敏試驗，但是培養時間較長，不利于臨床快速診斷及治療；Xpert檢測敏感度及特異度均較高，2 h內即可得到結果，同時可做利福平耐藥檢測，對臨床指導意義較大，但是僅能做利福平單藥藥敏試驗，對于耐多藥或者多耐藥患者不能及時發現，且費用昂貴；病理檢查結果表現為典型的上皮細胞樣肉芽腫性炎對結核性胸膜炎的診斷有指導意義，但是其對惡性胸腔積液的診斷卻有著明顯的優勢，本研究51例患者中有13例經病理檢查確診為惡性腫瘤，對胸腔積液的鑒別診斷意義重大。為避免漏診，胸膜活檢多需要在3～6個位點進行取材，可能導致3種檢查結果并不完全一致。因此，建議如果具備條件，3種方法同時進行檢查，相輔相成，彌補不足，可以為臨床醫生提供更精準的診斷依據。

六、總結

內科胸腔鏡活檢組織研磨懸液進行Xpert檢測在結核性胸膜炎診斷中具有以下優勢：(1)在內科胸腔鏡直視下取胸膜組織活檢標本，準確率更高；(2)活檢標本通過研磨后使標本液化，本研究選擇了MGIT 960培養及Xpert檢測方法，每家醫院還可以根據自身的條件做抗酸染色涂片、羅氏分枝桿菌培養、熒光定量PCR檢測、環介導等溫擴增檢測等檢查項目，擺脫了標本形態學上的限制；(3)活檢組織Xpert檢測的陽性結果明顯高于在胸腔積液中的陽性檢測結果，對臨床診斷意義更大。但由于本研究樣本量偏小，同時受胸膜活檢取材標本體積的限制，可能影響研究結果，在以后的工作中需要逐漸積累更多的患者資料；并引進海博刀系統等技術以提高活檢標本取材的體積，減少偏差，以期得到更準確的研究結果。