針對BACE1治療Alzheimer's病的進展

蘇義+魯艷紅+余昌胤

【摘要】AD患者腦中BACE1活性升高，導致Aβ生成增多。BACE1被證實是腦中主要的β-分泌酶，是Aβ形成的關鍵限速酶。BACE1抑制劑、BACE1基因敲除、BACE1siRNA治療、UPP調節劑可減少BACE1的表達或抑制其活性，降低Aβ水平。即使AD晚期階段患者，針對BACE1治療仍可能取得一定療效。抑制BACE1表達、降低其活性或干擾其功能已經成為治療AD的主要靶點。本文主要分別對此方面的研究進展綜述如下。

【關鍵詞】Alzheimer's病（AD）；β淀粉樣蛋白（Aβ）；淀粉樣前體蛋白β位裂解酶1（BACE1）；抑制劑；基因敲除；siRNA；泛素蛋白酶體通路（UPP）

【中圖分類號】R748 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-6851（2017）12-0-01

引言

AD是威脅全人類的常見疾病[1]，2050年近1億。病因迄今不明，可能與遺傳和環境因素等有關。基因檢測，心理測試，影像改變及腦脊液標志物Aβ42/P-Tau比率升高可診斷臨床前AD。AD病理特征早期細胞外淀粉樣老年斑（SP）和細胞內的過度磷酸化Tau神經原纖維纏結（NFTs）形成。后期逐漸進展為大腦皮質和邊緣海馬系統神經元的進行性變性和喪失，腦萎縮。SP的核心成分是β淀粉樣蛋白（Aβ），Aβ增多沉積是AD突出的病理改變。

若從根本上治愈或阻止病情發展必須減少SP產生，促進Aβ降解。通過抑制BACE1的表達，阻斷APP裂解，減少Aβ。相比γ-分泌酶，β分泌酶中BACE1作用相對單純，針對該酶治療AD療效較好，本文就針對BACE1治療AD的研究進展綜述如下。

1 BACE1的生物學特性

BACE1是一種新型的膜結合的天冬氨酸蛋白酶，由501個氨基酸殘基組成，BACE基因定位在11q2313，BACE在PH4.0-4.5活性最高，在胰腺和神經元中表達最高，在腦組織中活性最高[2-3]，是APPβ位點剪切酶1 （β-site APP-cleaving enzyme，BACE1）。在中樞神經突觸前膜末端濃度較高[4]，參與腦發育和神經軸突生長，調節神經髓鞘形成[5]。BACE1活性還受轉錄水平、翻譯后修飾及細胞內的許多分子的影響。泛素蛋白酶體通路是降解BACE1三種中主要途徑。抑制BACE1不但使Aβ生成減少，還使APP趨向于沿α-分泌酶途徑分解，在BACE基因缺失的小鼠腦中Aβ幾乎完全消失。

2 BACE1對Aβ的調控

在AD患者腦中BACE主要是BACE1，BACE2較少，主要分布在發生病變的額皮質、枕葉皮質、海馬。Aβ是βAPP的代謝產物。其中APP代謝與α、β、γ三種分泌酶有關，APP淀粉樣生成途徑通過BACE、γ分泌酶裂解APP為Aβ1-40和Aβ1-42。Aβ1-40和Aβ1-42，兩者比例約為9：1。AD患者腦組織中Aβ1-42增加，Aβ再聚集成不溶性高聚物導致SP形成，BACE1是產生Aβ的限速酶，抑制BACE1酶活性可減少Aβ產生及其毒性。

3 BACE1與AD的關系

AD患者Aβ沉積區BACE1的活性顯著增高。AD患者BACE1的活性與Aβ水平正相關，Aβ1-42通過多個病理毒性，導致AD。近年來研究發現AD病源學中危險因素和致病原因可導致腦組織中BACE1的mRNA、蛋白量活性和Aβ水平均明顯增加。在APP轉基因鼠和AD腦中敏感腦區BACE1活性顯著升高，Aβ形成分布和BACE1活性呈正相關，腦脊液中BACE1升高水平和SAD患者呈顯著相關，而且BACE1活性和Aβ1-42水平、總tau、磷酸化Tau在腦脊液中呈顯著正相關，但長期抑制BACE對以上指標無變化[6]。

4 針對BACE1治療AD

針對BACE1治療可從四個水平進行[7]：一是BACE1蛋白質水平，藥物下調BACE1表達和活性。二是BACE1mRNA水平，可通過RNAi抑制BACE1基因表達，降低或阻止BACE1mRNA轉錄；三是BACE1-DNA基因水平，如基因敲除，反義核酸技術，核酶技術等；四是促進BACE1降解。反義核酸技術和核酶技術應用DNA或RNA都是單鏈，性質不穩定，很容易受到體內核酶的降解，因此抑制效應短暫，不適于對基因功能長期調節，不適于對AD治療。

4.1 BACE1抑制劑治療AD

針對BACE1是腦內β-分泌酶的主要形式，BACE1抑制劑試驗顯示有效阻止Aβ的生成和沉積，副作用嚴重性相對小。世界各個科研和制藥公司競相開發BACE1抑制劑。

第一代肽類結構，天門冬氨酸蛋白酶抑制劑，對BACE1有較好選擇性和較高的抑制性，但這類BACE抑制劑都是鏈較長的肽類，短鏈的也是四肽、五肽，分子量較大，難以穿透血腦屏障為腦神經細胞所吸收，生物利用度低。同時肽類化合物穩定性差，易于為P糖蛋白轉運，易為蛋白酶水解，藥效作用時間短。β分泌酶包又含BACE1和BACE-2，兩者結構類似，都具有天冬氨酸蛋白酶的特性，以致抑制劑在抑制BACE1蛋白酶時，往往會交叉抑制蛋白酶家族其它成員，出現較多副作用，臨床難以推廣應用。

第二代非肽類BACE1抑制劑。非肽類BACE1抑制劑種類很多，如四氫化萘衍生物、異酞酰胺型BACE1抑制劑、含有氧磷基甲基和磷酰基甲基的琥珀酸和戊二酸類似物一些非肽類及含磷四肽類抑制劑、某些Macrocyclization型大環化合物等，小分子非肽類BACE1抑制劑仍表現出較難的膜通透性，研究人員通過實驗證明在抑制劑C-端多糖鏈上加上甾醇基有利于抑制劑入胞，且表現出更高的抑制活性[8]。體外實驗證實肝素類似物是有力的BACE1抑制劑，幾乎不影響凝血及抑制其它具有天冬氨酰蛋白酶結構的蛋白酶，但有劑量依賴性，是一種有望作為治療AD的新型BACE1抑制劑；動物模型中GSK188909、卡賓胺類BACE1抑制劑"TC-1"顯著減少腦內Aβ1-40和Aβ1-42的水平。endprint

第三代BACE1小分子抑制劑大多數在試驗階段，計劃在2024年完成全部研究。如低分子肝素C3表現出抑制BACE1降低Aβ治療AD[9]，藥物動力學和合適的大腦滲透，已經被證明是非常具有挑戰性的。AZD3293已獲FDA批準。

第四代新型制劑，如AP2469潛在的多功能治療AD藥物，兼有BACE1抑制性，AChE抑制性和抗氧化性能，具有減少Aβ42聚集改善認知功能[10]。

其他天然藥物TCM其他天然藥物如多種萜類、生物酚類、生物堿類如銀杏葉提取物、黃酮、丹參酮、旋覆花黃酮、大豆異黃酮、金釵石斛生物堿、木蘭醇、黃皮酰胺等均具有抗老年性癡呆的作用，但其作用機制與抑制BACE1相關性正在研究階段。

Hirata-Fukae等研究發現BACE1轉基因幼鼠內源性Aβ和BACE1同時顯著減少，但Aβ水平在BACE1轉基因幼鼠和野生型幼鼠卻相近，說明BACE1蛋白水平對內源性Aβ水平影響微小。在成年和老齡鼠腦中必然是其它的因素參與了對Aβ生成的調節引起Aβ增加，而用BACE1抑制劑也必然對臨床治療AD有益。

4.2 BACE1基因敲出

Steven等應用基因敲除策略，培育出BACE1基因缺陷（BACE1-/-）的小鼠，與正常小鼠（BACE1 +/+）比較，BACE1基因敲除后抑制了Aβ的生成，同時BACE1-/-基因敲除小鼠幼年和成年期無任何表型差異和生化生理及動作行為神經肌肉參數異常。這和PS基因敲除后引起顯著的發育異常形成鮮明的對比。

對BACEI-/-鼠很多細微的改變需繼續深入研究，如神經軸突，記憶損壞及減少肌梭和髓鞘形成，神經生化變化等。

4.3 RNAi干擾和siRNA干擾治療AD

siRNA治療AD的途徑目前有三個，一是通過移植RNAi基因修飾的神經干細胞到病變部位，同時誘導其向神經元和神經膠質細胞成功分化。由于RNAi基因修飾的神經干細胞中BACE1基因的表達量下調，這樣誘導分化的成熟的神經細胞或許能修復和替代受損的神經細胞，重建或恢復神經細胞間正常的遞質傳遞和信息聯系等功能，同時低表達BACE1基因的神經細胞有可能降低腦內Aβ濃度。二是通過不同方式把使表達載體轉染患者腦神經細胞，在細胞內表達載體生成siRNA沉默BACE1基因表達。如合成編碼BACE1siRNA的慢病毒載體轉染神經干細胞和鼠腦。三是通過體外轉錄合成siRNA，然后微創介入目標區神經組織，把siRNA導入到神經細胞內，發揮BACE1siRNA效應降解細胞內BACE1mRNA，下調AD患者神經細胞內BACE1mRNA的表達，從而使BACE1蛋白表達下降。

三種方式這在實驗中均得到抑制BACE1表達和減少Aβ生成的結果。在體RNAi還有顯著的困難，但RNAi在體阻滯基因表達是一種潛在的人類疾病治療途徑。RNAi是一種行之有效的治療AD方法。

4.4 針對泛素-蛋白酶體途徑（UPP）影響BACE1

BACE1可通過3種途徑降解[11]。UPP通過泛素化BACE1降解，參與調控BACE1裂解APP生成Aβ。泛素參與AD的NFT形成終末階段，泛素化后的蛋白質未能被降解，或UPP功能失調。Aβ可選擇性地抑制20s蛋白酶體糜蛋白酶樣活性，在病理狀態下通過抑制UPP26s蛋白酶體活性使泛素依賴性蛋白的降解發生障礙。Zhang等[12]研究發現，UCHL-1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1）也可促進蛋白酶體對BACE1的降解。ubiquilin-1和BACE1蛋白質水平正相關，ubiquilin-1通過影響BACE1導致Aβ積聚。蛋白酶抑制劑（如MG132），可增強Aβ對細胞誘導的毒性作用。開發合適的UPS調節劑改善蛋白酶體的功能，可發揮間接抑制BACE1的活性，可能是治療AD的新思路。

5 針對BACE1后對機體的影響

BACE1抑制劑、siRNA敲低BACE1基因表達和BACE1基因敲出均顯示出降低AD模型中BACE1活性，減少Aβ生成，逆轉AD病理改變等可喜的優點，但同時也表現了諸多副作用。基因敲除動物表型雖然正常，但體內BACE1完全消失，近來詳細資料研究提示潛在有害。

BACE1抑制劑治療后老年參與者CSF中BACE1活性與Aβ42，及Tau下降，且呈正相關[13]，特別是小分子抑制劑，對治療AD前景更樂觀。小分子抑制劑可對大腦BBB有效滲透，對腦BACE1高選擇，高清除Aβ藥動力學好[4]。

Maarten等[13]研究發現在周圍神經髓鞘形成時，BACE1表達水平明顯增高。應用BACE抑制劑后，缺乏BACE1導致未降解的NRG1的堆積。BACE1 -/-大鼠周圍神經髓鞘形成差，細傳入纖維軸索分離異常。這一點和III型NRG1基因突變及與施旺細胞有關的ErbB2基因敲除引起的變化非常相像。因NRG1需和ErbB受體結合促進周圍施旺細胞生成髓鞘。

Hu等通過對野生型小鼠和BACE基因敲除小鼠對照研究表明，BACE1遺傳基因缺失小鼠對疼痛的敏感性提高，握力降低，小鼠坐骨神經髓鞘形成差。表明髓鞘形成必須要BACE1參與；BACE1底物體內分布廣泛，不僅在APP代謝，NRG1方面；BACE1生成物功能多樣，通過自分泌和旁分泌發揮作用。

Wang等實驗研究發現敲除小鼠（BACE1 -/-）3-6個月齡動物出現行為障礙，海馬腦片電生理學記錄證明CA3區苔狀纖維突觸可塑性改變和突觸前功能嚴重短缺，表現為突觸前釋放減少，LTP傳遞功能缺失；BACE1基因敲除后出現髓鞘形成不足和異常全長的NRG1增多聚集使正常的NRG1缺乏。

Savonenko[14]等實驗究發現BACE1 -/-小鼠表現出更多副作用如易興奮、對谷氨酸能神經元興奮劑MK-801過度敏感、認知功能損壞等類精神分裂癥樣癥狀，這些表現對氯氮平治療有反應。BACE1 -/-小鼠腦中NRG1的受體ErbB4總量無變化，此信號傳導中連接ErB4的突觸后蛋白PSD95密度顯著性減少，與突觸密度減少。endprint

6 結語

AD重在病因治療，預防為先，需要個人和社會共同參與，選擇個體化的AD治療方法。動物模型中BACE1抑制劑可減少大腦淀粉樣蛋白沉積和改善認知障礙。其中選擇理想的BACE1抑制劑，是防治AD，延年益智的有效可行策略。

參考文獻

Reitz C，Mayeux R. AD：epidemiology，diagnostic criteria，risk factors and biomarkers， BiochemPharmacol，2014，88（4）：640-651.

Koo EH， Squazzo SL. Evidence thatProduction and release of amyloid beta-protein involves the endocyticPathway. J Biol Chem ，1994， 269（26）：17386-17389.

Sinha，S.Anderson，J.et al.Purification and cloning of amyloidPrecursor beta-secretase from human brain. Nature，1999，402（6761）：537- 540.

R.Vassar. BACE1 inhibition as a therapeutic strategy for AD.Journal of Sport and Health Science 2016，5：388-390.

]Hu X， Hicks CW， et al.BACE1 modulates myelination in the central andPeripheral nervous system. Nat Neurosci，2006，9（12）：1520-1525.

Maarten Timmers，Soraia Barao， et al. BACE1 dynamics upon inhibition with a BACE inhibitor and correlation to downstream Alzheimer's Disease markers in elderly healthyParticipants. Journal of Alzheimers Disease56（2017）：1437-1449.

Evin G，Hince C .BACE1 as a Therapeutic Target in Alzheimers Disease： Rationale and Current Status. Drugs and Aging.2013，30（10）：755-764.

Hussain I， Hawkins J， et al. Oral administration of aPotent and selective non-peptidic BACE1 inhibitor decreases beta-cleavage of amyloidPrecursorProtein and amyloid-betaProduction in vivo，J Neurochem，2007，100（3）：802-809.

Lee， John；Hejna， Mattew；etal. Low molecular weight heparin C3 as aPotential BACE inhibitor for the treatment of Alzheimer's disease.[J]，Neuropathology and Experimental Neurology.2015.6，6（74）：593.

Yu Wang，Hao Wang，etal.AChE inhibition-based multi-target-directed ligands，a novelPharmacological appoach for the symptomatic and disease-modifying therapy of Alzheimers disease. Current Neuropharmacology， 2016， 14， 364-375.

Motoki K，Kume H，etal.Neuronal β–amyloid generation is independent of lipid raft association of β-secretase BACE1：analysis with aPalmitoylation-deficinet mutant[J]. Brain Behav，2012，2：270-282.

Zhang M，Deng Y，etal. Control of BACE1 degradation and APPProcessing by ubiqutin carboxy1-terminal hydrolase L1[J]. J Neurochem，2012.120：1129-1138.

Maarten Timmers，Soraia Barao， etal. BACE1 dynamics upon inhibition with a BACE inhibitor and correlation to downstream AD markers in elderly healthyParticipants. Journal of AD56（2017）：1437-1449.

Liu CG，Wang JL，etal.MicroRNA-135a and -200b，potential Biomarkers for Alzheimer?s disease，regulate β secretase and amyloidPrecursorProtein[J]. Brain Res，2014，1583：55-64.endprint