免疫磁分離-兩重熒光定量PCR法快速檢測鮮豬肉中金葡菌和志賀氏菌

□ 楊 旭 山東銀寶食品有限公司

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

本實驗過程中所使用儀器包括：免疫磁分離系統（由美國Matrix公司提供），PCR熒光定量分析儀（由美國ABI公司提供）；電子天平；離心管；移液槍。

本實驗過程中所使用試劑包括：金黃色葡萄球菌多克隆抗體（由美國Matrix公司提供）；志賀氏菌多克隆抗體（由美國Matrix公司提供）；超順磁性納米微球（由上海AllMag公司提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫磁分離

將金葡萄球菌、志賀氏菌菌懸液1.0 mL劑量加入裝有免疫磁球離心管內，室溫狀態下結合反應30.0 min，利用免疫磁分離系統進行分離反應30.0 min，洗滌磁球-細菌重復3次，加入1.0 mL劑量1×PBS混懸液，以充分分散離心管內磁球，取洗滌后上層清液以及最終磁球混懸液200.0 μL劑量，涂布后在36.0 ℃下進行培養，維持24.0 h對檢測結果進行觀察。在此基礎之上利用移液槍將經處理后免疫磁球轉移至免疫磁分離系統磁球吸附磁鐵裝置上，稱取25.0 g劑量鮮豬肉樣本以及225.0 mL劑量NB培養基體系中接種金葡萄球菌、志賀氏菌菌液（菌液均為10倍稀釋），制備為250.0 mL待檢測體系，將體系放置于免疫磁分離系統上，循環富集反應時間為30.0 min，將經過上述處理后形成2.0 mL劑量金葡萄球菌、志賀氏菌菌體-磁球復合物混懸液作為待分析樣本，取200.0 μL劑量涂布后進行技術檢測，剩余混懸液進行DNA提取。

1.2.2 核酸提取

在4.0 ℃反應條件下取10 000.0 g待分析樣本，離心處理5.0 min后棄上層清液備用，使用金葡萄球菌、志賀氏菌菌基因組相對應DNA提取試劑盒進行DNA提取，對核酸純度、核酸濃度進行檢測，所提取DNA在-20.0 ℃條件下妥善保存。

表1 金葡萄球菌、志賀氏菌免疫磁球檢測結果示意表

1.2.3 兩重熒光定量PCR檢測

將經檢驗證實金葡萄球菌以及志賀氏菌陰性鮮豬肉樣本40份劃分為4組，每組內設置1份空白對照樣品，其他樣品分別接種金葡萄球菌以及志賀氏菌，對兩重熒光定量PCR檢測法下檢測限進行測定與分析。CFUg。各組均可準確檢出所添加標準金葡萄球菌、志賀氏菌菌株，對應陰性樣品檢測結果呈陰性。結果提示，金葡萄球菌、志賀氏菌在免疫磁分離-兩重熒光定量PCR法檢測下所對應檢測限分別為2.52 CFU/g以及1.36 CFU/g。所有樣品均用于測定金葡萄球菌、志賀氏菌株，檢測靈敏度、特異性以及準確性均為100%。

3 結論

2 實驗結果

2.1 免疫磁球特異性檢測

表1為金葡萄球菌、志賀氏菌的免疫磁球檢測結果示意表。結合表1數據可見，金葡萄球菌、志賀氏菌兩種免疫磁球均具有良好特異性。

2.2 檢測限

所選擇4組新鮮豬肉樣本分別接種金葡萄球菌、志賀氏菌，250.0 mL體系中金葡萄球菌終濃度區間為0.25 CFU/g～2 520.0 CFU/g，志賀氏菌終濃 度 區 間 為 0.136 CFU/g～1 360.0

本文通過實驗方式利用免疫磁分離-兩重熒光定量PCR法對鮮豬肉樣本中的金葡萄球菌以及志賀氏菌進行檢測，結果顯示免疫磁分離-兩重熒光定量PCR法能夠在6.0 h時間內完成對鮮豬肉樣本中金葡萄球菌以及志賀氏菌的檢測，具有檢測過程快速性、檢測結果靈敏度高、特異性高以及準確可靠等諸多優勢，可作為食品樣本中常見食源性致病菌的常規檢測方法之一，加以推廣應用。

[1]蔡亦紅.PCR快速檢測食品中志賀氏菌方法的建立[J].中國人獸共患病學報 ,2008(2)：150-153.