海洋放線菌酰基轉移酶基因的克隆

□ 馬艷玲 李海賢 翁 萍 劉澤璇 許小慶 曾 榮 佛山科學技術學院食品科學與工程學院

2000年后的海洋放線菌的研究受到極大的關注，強烈地吸引著各個領域的研究者[1]。其可以合成些具有結構新穎、功能多樣且生物活性廣泛的新型化合物[2-3]，為一些新型的抗生素的發現提供了珍貴的資源指導。

在人體機體內，有著多種酰基轉移酶，除了催化蛋白質的酰基化和去酰基化，還發揮著其他重要功能，例如脂酰輔酶A：膽固醇酰基轉移酶，所催化的膽固醇的酯化反應無論在細胞還是個體水平的膽固醇代謝平衡中都發揮了極其重要的作用是細胞內已知的唯一一個催化游離膽固醇與長鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶，是參與吸收、轉運和貯存膽固醇的一個及其重要的酶，可直接影響血液中膽固醇水平[4]。如何表達這些潛在的基因簇來解決食物污染及耐藥性問題一直是現在的重要研究方向，異體表達這些基因簇可以成為解決這個問題的方法之一[5-6]。因此通過生物轉基因技術研究海洋放線菌酰基轉移酶基因的克隆，能夠使海洋放線菌酰基轉移酶更好地產生各種獨特的具有生物活性的代謝物和酶。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

海洋放線菌Salinispora CNS-205，為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

大腸桿菌DH10B；限制性內切酶NdeI和EcoRI；DNA分子標準量marker；DNA聚合酶。DNA提取試劑盒，T4DNA 連接酶，凝膠回收試劑盒，質粒小提試劑盒，均購買自天根生化科技（北京）有限公司；其余均為國產分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組質粒的構建

PCR反應體系：H2O 28.5 μL，5×FAST HiFidelity PCR Buffer 10 μL， 20×FAST PCR Enhancer 2.5 μL， DMSO 2 μL，Template 2 μL，PrimerL 2 μL， PrimerR 2 μL， FAST HiFidelity polymerase 1 μL。PCR程序：升溫90 ℃，2 min；DNA變性95 ℃，30 s；退火53 ℃，30 s；引物延伸72 ℃，2 min；30周期后，72 ℃維持10 min，電泳。PCR產物的片段為雙鏈平末端，需通過酶切的方式將粘性末端暴露出來。酶切反應體系如下（50 mL反應體系）。

水 11 mL

EcoR I Buffer 5 mL

PCR回收樣品 30 mL

EcoR I 2 mL

Nde I 2 mL

然后放入37 ℃水浴鍋中水浴2 h，經膠回收后的PCR產物連入pUC18載體。酶連體系（20 mL反應體系）。

滅菌水 6 mL

PCR樣品回收片段 10 mL

PUC-18回收片段 1 mL

10×T4 DNA Ligase Buffer 2 mL

T4 DNA Ligase 1 mL

1.2.2 酶切驗證

用EcoR I和NdeI酶切，酶切反應體系如下（10 mL反應體系）。

水 6.2 mL

EcoR I Buffer 1 mL

抽提的質粒樣品 2 mL

EcoR I 0.4 mL

Nde I 0.4 mL

2 試驗結果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增

以海洋放線菌總DNA為模板, 用上述引物進行擴增，再EcoRI 和NdeI酶切回收。原PCR產物的目的條帶應位于大約1100bp處，然而酶切回收后，擴增產物經凝膠電泳檢測得出在約1100bp處有一條亮帶（如圖1所示）,有待進一步鑒定。

圖1 PCR電泳

2.2 重組質粒的驗證

圖2中第一個條帶在約2 700 bp左右，為載體的酶切條帶；第二個條帶位于1 100 bp左右，為目的基因的酶切條帶。得出該重組質粒后，測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。結果如圖2所示。

圖2 酶切驗證

3 討論

凝膠回收中向吸附柱加入液體應垂直且正中加入，否則會對實驗結果產生影響，特別是加入洗脫液時會決定實驗的成敗，同時避免桶破吸附柱。

[1]田新朋,張偲,李文均.海洋放線菌研究進展[J].微生物學報,2011(2)：161-169.

[2]KinSLam.Discovery of Novelmetabolites from Marine Acctinomycete[J].Curr Opin Microbiol,2006(9)：245-251.

[3]馬艷玲.海洋放線菌基因組文庫的構建和功能基因的克隆及序列分析[D].武漢：華中師范大學,2011.

[4]范東東,孫銘娟,王梁華,焦炳華.酰基轉移酶研究[J].生命的化學 ,2008(6)：701-703.

[5]馬艷玲,鄧海魏,箐箐,等.稀有海洋放線菌Salinispora arenicola非核糖體肽合成酶和鹵代酶生物合成基因簇核心區的克隆及序列分析[J].生物技術通報 ,2011(2)：157-162.

[6]JW.-H.Li, JohnC.Vederas.Drug Discovery and NaturalProd-ucts：End of an Era or an Endless Frontier[J].Science,2009(10)：161-165.