人臍帶間充質干細胞的研究進展及應用

王玲利

[摘 要]人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）具有低免疫原性，自我更新、增殖和多向分化的潛能；hUCMSCs具有來源廣泛、可塑性強、對供者無不利影響、無倫理限制問題等優(yōu)勢，使其成為組織工程、造血干細胞移植、細胞治療和基因治療中極具潛力的種子細胞，在研究及臨床應用方面也有十分廣闊的前景。

[關鍵詞]人臍帶；間充質干細胞；移植治療

中圖分類號：S785 文獻標識碼：A 文章編號：1009-914X（2018）02-0324-02

間充質干細胞（MSCs）根據其來源主要分為，骨髓間充質干細胞（BMSCs）、脂肪間充質干細胞（ADMSCs）和臍帶間充質干細胞（UCMSCs）。臍帶間充質干細胞（UCMSCs）的特性類似于骨髓間充質干細胞（BMSCs），因其增殖和分化潛能比BMSCs更高，獲取過程為非侵襲性，來源豐富、取材方便而成為科研和臨床工作中干細胞的一個較好來源。本文就近幾年國內外關于hUCMSCs的研究現狀和應用進行了綜述。

1 hUCMSCs的來源

人臍帶由三部分構成：羊膜被覆上皮、臍血管和位于兩者之間被稱為華氏膠的胚胎黏液結締組織。Mitchell[1]首次從華氏膠中提取出一種成纖維樣細胞，并證實了該類細胞具有多向分化的潛能。Romanov 等首先證明了臍帶組織中含有干細胞。隨后多位研究者從臍帶華氏膠中分離到這種成纖維樣細胞，證實其具有自我更新、增殖和多向分化的潛能，并命名為人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）。

2 hUCMSCs的分離培養(yǎng)

2.1 hUCMSCs的分離

目前hUCMSCs 的分離方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法兩種。其中，在分離培養(yǎng)的早期，酶消化法獲得的細胞數量更多，但含有其他類型的細胞，需要標記分離純化；組織塊貼壁法操作比較簡單，且傳代后的細胞形態(tài)及增殖活性更加穩(wěn)定，污染機會更小，培養(yǎng)體系中幾乎沒有造血細胞、內皮細胞或平滑肌細胞等。

2.2 hUCMSCs的培養(yǎng)

常用的hUCMSCs培養(yǎng)基為α-MEM或者低糖DMEM中加10%的胎牛血清、生長因子、抗生素和營養(yǎng)物質等，在5%CO2、37℃及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d需要更換一次培養(yǎng)液，原代培養(yǎng)大約2周，當貼壁細胞80～90%融合時，就可按1：3進行傳代培養(yǎng)，2～3d后就可得到較為純凈且均勻一致的細胞系。研究顯示，酸性培養(yǎng)基Mesencult更有利于臍帶血細胞的生長，并能形成克隆；經低強度脈沖式超聲波處理的臍帶及傳代細胞，在同等條件下能獲得對照組3倍數量的細胞，并且細胞的擴增能力明顯增強，但持續(xù)的低強度超聲波反而會降低細胞的增殖能力[2]。

3 hUCMSCs的生物學特性

3.1 hUCMSCs的細胞形態(tài)

分離得到hUCMSCs后，培養(yǎng)24h，可在倒置顯微鏡下觀察到貼壁形態(tài)相對均一的梭形細胞，呈平行排列生長或者旋渦狀生長，在低密度時較扁平，密度增加趨于融合時細胞就變得細長，也可觀察到多角形的細胞。掃描電鏡下觀察到細胞呈長條狀纖維樣，表面不光滑，細胞有小結節(jié)狀物，無明顯突起，細胞間無網狀連接。

3.2 hUCMSCs的生長、增殖特點

細胞的原代培養(yǎng)一般需要10～14d，待細胞融合達80%后進行傳代培養(yǎng)，接種后2～4d增長趨勢最為明顯。對細胞周期分析發(fā)現，第2～6代的hUCMSCs為正常的二倍體細胞，80%的細胞處于G0～G1期，處于活躍增殖期的細胞較少。早期細胞生長呈增長的趨勢，潛伏期一般不超過36h，之后進入對數增長期，一般持續(xù)到第6～8d，之后進入平臺期，呈現典型的“S”型增長方式。

3.3 hUCMSCs的免疫表型及免疫標記

目前研究發(fā)現，hUCMSCs沒有特異的表面抗原，但可形成表面蛋白作為抗原標記，4～8代的hUCMSCs表面標記較為穩(wěn)定。通常hUCMSCs高表達間充質干細胞標記和黏附分子標記，低表達移植相關的表面標記MHC-I類分子標記等，弱表達CD106，不表達造血干細胞標記、內皮細胞標記、單核巨噬細胞表面標記CD14及與淋巴功能相關的抗原lαCD11a，也不表達MHC-Ⅱ類分子標記及CD80、DC86等HLA抗原識別有關的共刺激因子。大量研究表明hUCMSCs是更原始的間充質干細胞群，可能具有更強的可塑性和極低的免疫原性，類似于稀少的成人多能祖細胞。

3.4 hUCMSCs的免疫原性

hUCMSCs具有極低的免疫原性和誘導免疫耐受能力。研究發(fā)現，hUCMSCs低表達HLA-ABC，不表達HLA-DR，也不表達共激分子CD80和CD86，而細胞表面共激分子是T細胞活化劑增殖過程中必需的信號系統(tǒng)。在小鼠試驗中發(fā)現，UCMSCs不刺激小鼠淋巴細胞增殖，還可以顯著抑制小鼠淋巴細胞的反應。以上研究說明hUCMSCs不僅具有較低的免疫原性，還能抑制免疫活性細胞的增殖。

3.5 hUCMSCs的分化潛能

hUCMSCs具有強大的多向組織分化能力，可向外胚層、中胚層及內胚層細胞分化。大量研究證實，hUCMSCs在體內可分化為神經細胞、骨骼細胞、內皮細胞、心肌細胞、光敏感感受神經細胞、多巴胺能神經元細胞等；在體外可分化為脂肪細胞、成骨細胞、骨骼肌細胞、成軟骨細胞、神經細胞、內皮細胞、神經膠質細胞、肝細胞、多巴胺能神經細胞、神經細胞、平滑肌細胞、胰島樣細胞及生殖細胞等[3]。

研究發(fā)現，hUCMSCs經成骨誘導后，堿性磷酸酶（ALP）活性增高（未誘導的臍帶貼壁細胞中無ALP），并表達骨涎蛋白（ON），證實了hUCMSCs具有成骨潛能。誘導hUCMSCs向多巴胺神經元轉化的研究表明，絡氨酸羥化酶（TH）陽性標志率為12.7%，而培養(yǎng)基中有多巴胺釋放。將來自臍動脈、臍靜脈及全部臍帶的細胞進行體外培養(yǎng)，三種來源的細胞均有肌成纖維細胞的活性。Baksh發(fā)現hUCMSCs向脂肪細胞誘導時可產生豐富的脂肪小滴，Wang研究表明hUCMSCs可誘導分化為神經細胞。

4 hUCMSCs的移植應用

近年來，hUCMSCs在細胞替代治療和再生醫(yī)學、組織工程學等應用領域成為研究熱點，在體外誘導hUCMSCs分化及動物體內移植等方面取得了令人矚目的成績，為臨床應用的可行性、安全性提供了可靠的理論支撐和實踐基礎。

4.1 hUCMSCs在組織工程中的應用

有研究者利用hUCMSCs在血管生物反應器內成功構建出了人工血管，而通過透射鏡及組織學等檢測發(fā)現該人工血管的形態(tài)和機械強度均與人的肺動脈相接近。Kadber等將hUCMSCs接種于PGA/P4HB生物聚合體上能產生大量的種子細胞，且細胞的增殖速度明顯增加。

4.2 hUCMSCs移植治療神經疾病

中樞神經系統(tǒng)損傷會導致嚴重的功能障礙，但目前尚無神經系統(tǒng)損傷后修復和再生的有效措施，外源性細胞替代治療是神經修復重建的有效治療策略之一。

將hUCMSCs移植入光感受器退變老鼠的視網膜下，hUCMSCs分泌的神經營養(yǎng)因子對視覺的修復有很大的作用，尤其是腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF），能有效地修復視覺功能[4]。hUCMSCs也有向大腦缺血區(qū)域遷移的能力，在損傷區(qū)域向膠質細胞、血管內皮細胞和神經細胞分化，促進損傷部位血管及神經的再生。有研究認為是源于hUCMSCs的神經保護以及它分泌的各種營養(yǎng)因子在機體損傷修復中起到重要作用，也有學者認為在hUCMSCs衍生的巨噬細胞和小膠質細胞的相互調節(jié)下，干細胞整合素的表達增強才是hUCMSCs移植后缺血大腦神經損傷修復的關鍵因素。但目前關于hUCMSCs改善大腦缺血癥狀的機制還沒有統(tǒng)一結論，有待進一步的研究。

另外，hUCMSCs在治療脊髓損傷中也有顯著的效果，移植到宿主損傷脊髓后可促進脊髓神經功能的恢復。Yang發(fā)現，UCMSCs有助于完全性橫貫性脊髓損傷大鼠運動功能的改善；未經體外誘導的hUCMSCs可在脊髓損傷的大鼠體內向神經元、少突膠質細胞和星形膠質細胞分化，減少膠質瘢痕，促進脊髓損傷大鼠的神經功能的恢復[5]。可見，hUCMSCs為治療腦缺血、脊髓損傷等神經系統(tǒng)相關的疾病提供了廣闊的應用前景。

4.3 hUCMSCs移植治療心血管疾病

心肌細胞缺乏再生能力，在局部缺血損傷時心肌細胞的死亡會導致心力衰竭，采用健康人的不同干細胞替代治療并增強心臟功能成為細胞工程治療的研究熱點。研究證實，hUCMSCs在經過5-氮胞苷誘導后可分化為心肌細胞，表達鈣黏蛋白和心肌鈣蛋白Ⅰ，在形態(tài)學上可以觀察到誘導分化后的hUCMSCs能產生自律搏動，說明hUCMSCs可分化成心肌細胞，可以作為心肌細胞的來源。

高連如等[6]把hUCMSCs移植于由冠心病引起的慢性心臟功能衰竭者，移植2周后發(fā)現，患者心功能左室射血分數提高了13%，患者夜間能夠平臥入眠，并無陣發(fā)性呼吸困難的現象。將來源于hUCMSCs和臍血的內皮細胞移植到人工心瓣膜支架上，利用生物效應器模擬體內心瓣膜的工作環(huán)境，再通過生物與機械刺激作用，可獲得具有活力的人造心瓣膜，且該瓣膜表現出成熟的分層組織結構及含有功能的內皮細胞與細胞外基質產物，可見，hUCMSCs可在組織工程中作為人工心瓣膜的來源。

4.4 hUCMSCs與糖尿病和腫瘤病

將hUCMSCs移植到患糖尿病的大鼠體內，60d后能在大鼠胰島腺中檢測出人胰島素基因，說明hUCMSCs具有向胰島樣細胞分化的潛能。在體外將hUCMSCs誘導成胰島小島樣細胞團，該細胞可表達胰島以及胰島β細胞的相關基因，將其移植入糖尿病老鼠模型，可以大大降低血糖水平，有效改善老鼠體重減輕的癥狀，并沒有移植排斥反應發(fā)生，表明hUCMSCs能分化為成熟的胰島β樣細胞，在Ⅱ型糖尿病中可作為胰島β細胞替代治療的理想來源。

研究發(fā)現，hUCMSCs可向人乳腺癌細胞（MDA231）遷移，腫瘤細胞分泌的化學增活素SDF-1、VEGF等能刺激hUCMSCs向腫瘤細胞遷移，由此可知，hUCMSCs可作為腫瘤藥物載體做靶向治療。研究還表明，hUCMSCs通過下調細胞凋亡相關的信號轉導通路AKt和MAPK，以刺激內在凋亡通路，從而減輕腫瘤細胞的負荷。

4.5 hUCMSCs與生殖系統(tǒng)疾病和肝臟疾病

hUCMSCs在精原細胞的培養(yǎng)條件下進行誘導培養(yǎng)可使其由成纖維細胞形變?yōu)閳A形，并有少數圓形的細胞分化呈蝌蚪狀，而且能表達精原細胞的特征性標記CD117和CD49f，證實了hUCMSCs具有向精原細胞分化的潛能，這就有可能為男性不育患者提供了干細胞來源和新的治療途徑。

研究顯示，利用肝細胞生長因子誘導hUCMSCs向肝細胞分化，分化的細胞表達肝細胞表面標記物CK18、CK19、ALB和AFP，糖原PAS染色呈現陽性，說明了誘導后的細胞具有干細胞的性質。目前研究表明，hUCMSCs在體外、體內均可誘導成肝樣細胞，為臨床上治療急性肝衰竭、慢性終末期肝病提供了新思路。

4.6 hUCMSCs與免疫系統(tǒng)疾病

MSCs對免疫系統(tǒng)的調節(jié)主要涉及T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞。MSCs通過抑制細胞的分裂來抑制T淋巴細胞的增殖。研究表明MSCs通過減少間充質相關抗原CD1a、CD86、HLA-DR 的表達來抑制單核細胞向DC的分化，從而調節(jié)免疫功能。MSCs作為一種新興的干細胞，具有重要的免疫調節(jié)功能，為異基因造血干細胞移植和自身免疫性疾病的治療開辟新道路。

5 前景及展望

研究表明，hUCMSCs將成為自體與同種異基因移植的理想細胞來源。由于hUCMSCs的生物學特性、多向分化潛能、不表達或低表達免疫排斥相關的標記等特點，使其在臨床再生醫(yī)學方面的研究應用取得了較好的結果，同時也被看作細胞治療的理想靶細胞。

但是，目前關于hUCMSCs在治療應用方面的研究僅限于臨床試驗，對hUCMSCs在臨床上的應用還需要大量的試驗及臨床研究，才能從理論和技術上證實它對各種疾病的治療潛能。此外，進一步闡明hUCMSCs的生物學特點，冷凍/溶解技術以控制其生長和誘導定向分化，對hUCMSCs長期傳代后有無惡變傾向，惡變的檢測控制以及在擴增分化方面達成共識，這些對于hUCMSCs移植治療的應用十分重要。

參考文獻

[1] Mitchell K E，Weiss M L，Mitchell B M，et al.Matrix cells from Whartons jelly form neurons and glia[J].Stem Cells，2003，1：50-60.

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[3] Huang Peng，Lin Li-Min，Wu Xiao-Ying，et al.Differentiation of human umbilical cord Whartons jelly-derived mesenchymal stem cells into germ-like cells in vitro[J].J Cell Biochem，2010，109（4）：747-754.

[4] Lund R D，Wang Shaomei，Liu Bin，et al.Cells isolated from umbilical cord tissue rescue photoreceptors and visual functions in a rodent model of retinal disease[J].Stem Cells，2007，25（3）：602-611.

[5] 韓明遠，馮世慶，李輝，等.移植人臍帶間充質干細胞修復大鼠脊髓損傷[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，19：3483 -3489.

[6] 高連如，張寧坤，陳宇，等.臍帶華通膠來源的間充質干細胞在心力衰竭細胞移植治療中的應用[P].中國組織工程研究與臨床康復，101690731A，2010-04-07.