HPLC柱前衍生化測定野生與養殖全蝎中游離牛磺酸含量

桑 曉 王立娜 姜 悅 馬明珠 王集會

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

工藝·試驗

《Technology&Experiment》

HPLC柱前衍生化測定野生與養殖全蝎中游離牛磺酸含量

桑 曉 王立娜 姜 悅 馬明珠 王集會

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

采用水提法提取野生全蝎與養殖全蝎中的游離牛磺酸，PITC柱前衍生化后進行反相高效液相色譜分析，用高效液相外標一點法測牛磺酸含量。牛磺酸在0.008 4～0.420 8 μg范圍內呈良好的線性關系(R2=0.999 8);加樣回收RSD為1.38%(n=6)；精密度RSD=1.14%(n=6)。該方法靈敏度高，重復性好，回收率高，可用于全蝎的質量檢測與控制。

養殖全蝎 野生全蝎 牛磺酸 含量 衍生化

全蝎為鉗蝎科動物東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch的干燥體，辛、平、有毒。具有息風鎮痙、攻毒散結，通絡止痛之功效。臨床上用于治療驚風、抽搐痙攣、中風口渴、半身不遂、破傷風、風濕麻痹、偏正頭痛、瘡瘍、瘰疬等[1]。全蝎藥材質量受其生長環境、蝎齡、性別、采收時間、產地加工方法等多種因素的影響。目前，野生全蝎資源稀少，人工養殖全蝎已經成功，野生全蝎和養殖全蝎一樣可以入藥。因此，通過研究野生全蝎與養殖全蝎中有效成分含量的對比，對控制其質量有重要意義。

全蝎用于息風鎮痙，與牛磺酸的鎮靜、抗血小板聚集、抗驚厥作用類同，可以認為牛磺酸是全蝎有效成分之一[2]。因此野生全蝎與養殖全蝎中牛磺酸含量，可以作為評價野生全蝎與養殖全蝎的質量指標。牛磺酸的測定方法有分光光度法[3]、自動電位滴定法[4]、薄層掃描法[5]、氨基酸自動分析儀法[6]、柱后衍生法[7]、柱前衍生高效液相法等。其中，因為液相色譜法準確度和精密度較好，儀器普及率較高，因此柱前衍生化高效液相色譜法已被國家標準GB5009.169-2003收錄作為測定牛磺酸的第一法[8]。目前常用的柱前衍生試劑有鄰苯二甲醛(OPA)[9]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[10]、異硫氰酸苯酯(PITC)等。OPA衍生法速度迅速，但不能同時衍生一、二級氨基酸且衍生產物不穩定[11]。以PITC作為柱前衍生劑的氨基酸分析方法以其反應速度快，產物單一、穩定、與一級、二級氨基酸均可反應等特點而得到廣泛的應用[12],與紫外檢測器結合靈敏度高,檢測限低。

本研究采用異硫氰酸苯酯(PITC)為衍生試劑，建立了野生全蝎與養殖全蝎中牛磺酸的反相高效液相測定方法。所建立的條件方法穩定性高、操作簡單、準確可靠，具有較高的靈敏度，可用于全蝎中游離牛磺酸含量的測定。

1 材 料

1.1 藥材與試劑

正己烷，冰醋酸、乙酸鈉為色譜純,天津市科密歐化學試劑有限公司生產；乙腈、甲醇為色譜純，上海星可高純溶劑有限公司生產；三乙胺為色譜純，天津市化學試劑一廠生產；娃哈哈純凈水，娃哈哈公司生產；牛磺酸標準品，中國食品藥品檢定研究院生產;異硫氰酸苯酯(PITC)，阿拉丁。

野生全蝎和養殖全蝎均購自山東臨沂，均為活蝎，經山東中醫藥大學生藥系徐陵川教授鑒定為鉗蝎科東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch。選擇成年蝎，剔除幼蝎，凍死，粉碎成勻漿，冷凍干燥成粉。養殖全蝎也購自山東臨沂，選擇成年蝎，剔除幼蝎。養殖全蝎與野生全蝎同法處理。

1.2 儀器

FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司出品)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司出品)；LC-10AT VP(日本島津公司出品)；Mettler AE240 電子天平(瑞士梅特勒公司出品)；LGJ_-18A冷凍干燥離心機(北京四環科學儀器廠有限公司)。

2 方 法

2.1 溶液的配制[13]

2.1.1 衍生化試劑的配制:精密量取0.3 mL PITC，置于25 mL的棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為0.1 mol·L-1，搖勻，4 ℃保存，作為PITC的乙腈溶液；精密量取14 mL三乙胺，置于100 mL棕色量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，濃度為1 mol·L-1，搖勻，作為三乙胺的乙腈溶液。

2.1.2 對照品溶液制備：精密的稱取牛磺酸對照品10.43 mg，用蒸餾水溶解并定容至25 mL制成質量濃度為0.4177 mg.mL-1的對照品溶液A。

2.1.3 樣品溶液的制備：精密稱取兩種全蝎粉末各0.500 0 g，按最佳超聲提取工藝提取，定容至100 mL。

2.1.4 衍生化步驟：精密吸取待分析溶液5 mL于25 mL棕色量瓶中，精密加入0.1 mol.L-1PITC的乙腈溶液2.5 mL，1 mol.L-1三乙胺的乙腈溶液2.5 mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%的乙腈稀釋至刻度，搖勻。精密移取5 mL，加入5 mL正己烷，振搖后放置10 min，取下層溶液，用微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續濾液，既得。

2.1.5 空白溶液的制備: 精密吸取5 mL蒸餾水于25 mL棕色容量瓶中，按上述方法進行衍生化。

2.2 色譜條件[13]

2.2.1 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 nm×4.6 nm，5 μm)以0.07 mol.L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液-2.5%乙腈(pH=6.5)為流動相A，以乙腈-甲醇-水(40∶15∶45)為流動相B進行梯度洗脫：0～15 min 96.5%→89%A，15～30 min 89%→0%A，30～45 min 0%A，檢測波長為254 nm，流速為1.0 mL.min-1，進樣量為5μL。用外標一點法測定牛磺酸含量。在上述條件下分別獲得空白、標準品、野生全蝎和養殖全蝎衍生化后的牛磺酸色譜圖，見圖1、圖2、圖3、圖4。

2.2.2方法學考察

2.2.2.1 線性關系考察:分別精密吸取上述對照品溶液(質量濃度為0.417 7 mg·mL-1)用水稀釋成6個不同濃度的對照品稀釋液，按上述方法進行衍生化并按上述色譜條件測定峰面積，以牛磺酸對照品進樣量(μg)為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)，以最小二乘法計算回歸方程。結果見圖5。

2.2.2.2 精密度試驗：取上述對照品溶液進行衍生化并測定峰面積，連續進樣6次。

2.2.2.3 加樣回收率試驗：稱取已知牛磺酸含量的樣品6份，每份0.125 0 g，置具塞錐形瓶中，分別精密加入牛磺酸對照品溶液(質量濃度為0.420 8 mg·mL-1)1.0 mL，水7 mL，6 mL、6 mL，按最佳超聲工藝超聲，制備樣品溶液，進行色譜分析，計算回收率，結果見表1。

2.2.2.4 重復性試驗：稱取養殖全蝎樣品6份，精密稱定，按照“2.1.3”中的方法制備樣品溶液，按上述方法進行衍生化并按上述色譜條件測定峰面積，計算牛磺酸含量。

2.2.3 含量測定：取三批野生全蝎和養殖全蝎樣品，精密稱定，按照“2.1.3”中的方法制備樣品溶液，按上述方法進行衍生化并按上述色譜條件測定峰面積，計算樣品中牛磺酸含量，結果見表2。

3 結 果

3.1 高效液相色譜圖

圖1 空白溶液Fig 1 Blank solution

圖2 標準品Fig 2 Standard product

圖3 野生全蝎Fig 3 Wild scorpion

圖4 養殖全蝎Fig 4 Domesticated scorpion

3.2 標準曲線方程及線性范圍

回歸方程為Y=3E+06X+6083.4 r=0.9998;表明牛磺酸在0.0084-0.4208 μg范圍內，進樣量與峰面積之間呈良好的線性關系。見圖5。

圖5 牛磺酸標準曲線圖Fig 5 Standard curve of taurine

3.3 精密度

取上述對照品溶液進行衍生化并測定峰面積，連續進樣6次。計算峰其面積的RSD為1.14%(n=6)，結果表明精密度良好。

3.4 加樣回收率試驗結果見表1

表1 牛磺酸加樣回收試驗結果Table 1 Results of taurine addition n=6

3.5 重復性試驗結果

計算得牛磺酸平均含量為1.1267%，RSD=1.39%(n=6)，表明重復性良好。

3.6 含量測定結果

表2 三批樣品中游離牛磺酸的含量測定結果Table 2 Determination of free taurinein three batches of samples n=3

4 討 論

全蝎中除含有牛磺酸成分外，還有蝎毒素、Ca、Mg、Fe等微量元素。但是蝎毒素單體(活性多肽)的分離、純化操作過于繁瑣，結構鑒定較困難，很難滿足作為定量分析用化學對照品在純度、數量上的要求。而全蝎中牛磺酸的提取相對簡單，又是息風鎮痙有效成分之一，所以選擇牛磺酸作為野生全蝎與養殖全蝎的質量控制指標。

PITC柱前衍生法是利用PITC與氨基酸反應生成穩定的且具有強烈紫外吸收的苯氨基硫甲酰衍生物，然后再利用C18柱和帶有二元梯度的高效液相色譜及紫外檢測器測定。該方法能夠用于對全部氨基酸(包括一級胺和二級胺)的測定，檢測限低，線性好，重現性好。本文考察了進樣5μL和20μL對色譜峰的影響，結果表明進樣5μL出峰效果好，分離度大；進樣20μL雖然可以提高檢測的靈敏度和準確度，但是分離度低，容易出現峰變寬、拖尾的現象，并且PITC毒性大，極性小，對色譜柱損傷嚴重。

本實驗所用的野生全蝎與養殖全蝎樣品均購自山東臨沂，經鑒定均為東亞鉗蝎ButhusmartensiiKarsch，藥材為全蝎凍干粉。通過對野生全蝎與養殖全蝎牛磺酸含量的測定，結果表明，養殖全蝎與野生全蝎相比，養殖全蝎中牛磺酸含量相對較高，推測人工養殖全蝎的生長環境比野生全蝎的生長環境更為適合全蝎的生長，食物較為充足，因此牛磺酸含量相對較高。

[1] 陳秀敏.全蝎不良反應分析[J].時珍國醫藥,2003,14(10):635.

[2] 黃曉丹,侯少貞,李耿 等.中藥有效成分牛磺酸綜述[J].中國民間療法,2005,13(9):64～65.

[3] 李秀娟，魯曾，黃賢剛.牡蠣中牛磺酸含量測定方法的建立[J].食品與機械,2010,26(5):81～83.

[4] 張彤,山廣志,陳思.自動電位滴定法測牛磺酸含量[J].首都醫藥,2009,16(10):63～64.

[5] 惠秋沙.薄層掃描法測定保健飲料中牛磺酸的含量[J].食品與藥品,2011,13(4):276～278.

[6] 蔡梅，吉文亮，劉華良 等.氨基酸自動分析儀對食品中牛磺酸快速測定方法研[J].中國衛生檢驗雜志, 2013(1):41～42.

[7] 張彤，山廣志，余立.柱后衍生HPLC法測定牛磺酸滴眼液的含量[J].中國藥品標準,2010,11(5):330～332.

[8] 石巖，宋光西，熊婧 等.PITC柱前衍生化法測定保健食品中牛磺酸的含量[J].中國藥事,2012, 26(2):144～146.

[9] 孫變娜，沈和定，吳洪喜 等.高效液相色譜法測定4種石磺中牛磺酸的含量[J].海洋漁業,2015, 37(1):93～98.

[10] 黃麗丹，邢亞東，王玲玲 等.2,4-二硝基氟苯柱前衍生化HPLC法測定保健食品中牛磺酸含量[J].藥物分析雜志,2016(1):171～175.

[11] 汪媛，王海龍，金高娃 等.PITC柱前衍生HPLC測定復方氨基酸注射液中18種氨基酸的含量[J].世界科學技術:中醫藥現代化,2014(6):1 347～1 352.

[12] 鐘其頂，高紅波，熊正河 等.PITC柱前衍生高效液相色譜法測定黃酒中17種氨基酸方法研究[J].釀酒，2010,37(5):74～76.

[13] 蒲秋易，張一竹，張二云 等.柱前衍生化高效液相色譜法測定全蝎中游離牛磺酸的含量[J].中國新藥雜志,2013(2):230～234.

TheDeterminationofFreeTaurineContentsBytheRP-HPLC-PITCPrecolumnDerivatizationintheWildandDomesticatedScorpion

Sang Xiao Wang Lina Jiang Yue Ma Mingzhu Wang Jihui

(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Shandong Jinan 250355)

The free taurine of the wild and domesticated scorpion were extracted with water respectively.The RP-HPLC-PITC precolumn derivatization were used to measure the contents of free taurine. The linearity of the taurine derivative was good in the range of 0.008 4～0.420 8 μg (r=0.999 8).The average recovery was 99.7% with RSD of 1.38% (n=6); precision RSD=1.14% (n=6). The method with high sensitivity, good reproducibility and high recovery rate, could be used for quality detection and control of scorpion.

Domesticated scorpion wild scorpion Taurine content derivatization

10.16597/j.cnki.issn.1002-154x.2017.03.006

2017-01-24

山東中醫藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(編號:2015315)；2015年國家級大學生創新創業訓練計劃項目(項目編號：201510441010)。

桑曉(1996～)，女，本科生，研究方向:制藥工程；通訊作者：王集會(1962～)，男，副教授，研究方向:蟲類中藥發酵及活性成分研究，E-mail: wangjihui10@ 126. com。