低氧條件下辛伐他汀對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能的影響

姚 建，蘇開(kāi)新，王海華，郭 虎

（株洲市中心醫(yī)院燒傷整形外科 湖南 株洲 412007）

目前瘢痕疙瘩的發(fā)生主要與功能異常的成纖維細(xì)胞有關(guān)，治療藥物作用機(jī)理為抑制或阻斷瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖、侵襲及膠原形成等生命活動(dòng)[1-3]。辛伐他汀除降脂作用外，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗器官纖維化的作用[4-5]。辛伐他汀能明顯減少兔耳增生性瘢痕的形成[6]，還能抑制人鼻息肉成纖維細(xì)胞的增殖和膠原分泌[7]。研究表明，低氧也是瘢痕疙瘩發(fā)病的一個(gè)重要因素，可通過(guò)增加成纖維細(xì)胞中促血管形成因子合成、分泌等促進(jìn)瘢痕疙瘩的發(fā)展[8-9]。但未見(jiàn)低氧條件下辛伐他汀對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞作用的相關(guān)報(bào)道。本研究探討低氧條件下辛伐他汀對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表達(dá)的影響及相關(guān)作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用辛伐他汀防治瘢痕疙瘩生成提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC、碘化丙啶（PI）購(gòu)自美國(guó)BD公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo Fisher公司；CCK-8試劑、細(xì)胞裂解液、上樣緩沖液、脫脂奶粉、PVDF膜購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)公司；組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP-1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 (connective tissue growth factor, CTGF)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)、Ⅰ型膠原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Caspase-3、β-actin、Bax、Bcl-2抗體和二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)公司 (Proteintech Group,Inc)；ECL顯色試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技公司。酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國(guó))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher，美國(guó))，流式細(xì)胞儀(BD，US)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：瘢痕疙瘩標(biāo)本取自株洲市中心醫(yī)院整形外科就診患者，患者術(shù)前1周未接受任何藥物和手術(shù)治療，患者均知情同意，并經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將瘢痕疙瘩組織去除表皮和皮下組織后，剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻平鋪于75cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3d更換1次新鮮培養(yǎng)基。1～2周后原代細(xì)胞爬出組織塊并匯合成片，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取4～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)研究。將含2% O2低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36h的成纖維細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組，對(duì)照組基礎(chǔ)上添加10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細(xì)胞設(shè)為干預(yù)組。辛伐他汀購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，用二甲基亞砜配制成濃度為10mmol/L的辛伐他汀母液，過(guò)濾除菌后，待用。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的成纖維細(xì)胞以每孔5 000個(gè)/100μl接種于2塊96孔板，培養(yǎng)24h后去除96孔板中的培養(yǎng)基，各孔加入100μl含辛伐他汀濃度分別為0、0.1、1、10、50、100μmol/L的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，藥物添加后常氧培養(yǎng)箱和2% O2低氧培養(yǎng)箱各放置1塊96孔板處理36h，培養(yǎng)結(jié)束后加入100μl DMEM、10% CCK-8溶液，37℃孵育2h上機(jī)檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。細(xì)胞存活率計(jì)算方法：細(xì)胞存活率(%)=(干預(yù)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：在低氧條件下用10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細(xì)胞36h，收集兩組細(xì)胞，PBS懸浮漂洗2次，每個(gè)樣品加入5μl Annexin V-FITC按照試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行染色，避光反應(yīng)0.5h，加入10μl PI后1h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá)：在低氧條件下用10μmol/L辛伐他汀處理成纖維細(xì)胞36h，收集兩組細(xì)胞并充分裂解，離心收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，高溫水浴使蛋白變性，使用微量進(jìn)樣器上樣（上樣量為20μl），SDS-PAGE電泳分離，將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉，一抗孵育4℃過(guò)夜，其中β-actin抗體稀釋比例為1:2 000，其它抗體稀釋比例為1:1 000，一抗孵育結(jié)束后洗膜，孵育二抗，二抗稀釋比例為1:5 000，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，定影，拍照，使用Image Pro Plus6.0軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度掃描半定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀在低氧條件下對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響：常氧和低氧條件下辛伐他汀作用36h，隨著藥物濃度的增加成纖維細(xì)胞存活率逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；當(dāng)藥物濃度≥10μmol/L時(shí)，與常氧組相同濃度比較，低氧組細(xì)胞存活率顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果說(shuō)明低氧條件下辛伐他汀對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)。見(jiàn)表1。

2.2 辛伐他汀在低氧條件下對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響：辛伐他汀作用36h，干預(yù)組成纖維細(xì)胞凋亡率明顯大于對(duì)照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，干預(yù)組細(xì)胞促凋亡因子Bax、Caspase-3表達(dá)增加，而凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)減少，見(jiàn)圖2。以上結(jié)果說(shuō)明低氧條件下辛伐他汀可通過(guò)上調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)，下調(diào)Bcl-2促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡。

圖1 辛伐他汀在低氧條件下對(duì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響

圖2 辛伐他汀對(duì)低氧條件下成纖維細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.3 辛伐他汀在低氧條件下對(duì)成纖維細(xì)胞中瘢痕生成相關(guān)因子的影響：與對(duì)照組比較，干預(yù)組成纖維細(xì)胞中瘢痕生成相關(guān)因子HIF-1α、Ⅰ型膠原、CTGF蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，TIMP-1表達(dá)水平則明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 辛伐他汀對(duì)低氧條件下成纖維細(xì)胞中瘢痕生成相關(guān)因子表達(dá)的影響

3 討論

瘢痕疙瘩的發(fā)生是多因素共同作用的一個(gè)復(fù)雜病理過(guò)程，而瘢痕成纖維細(xì)胞在其中扮演著重要角色。瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，凋亡率較正常皮膚成纖維細(xì)胞低，且對(duì)誘導(dǎo)凋亡的刺激耐受性增強(qiáng)，膠原合成能力增強(qiáng)，膠原降解能力減弱，并伴隨相關(guān)細(xì)胞因子及受體表達(dá)的改變，這些異常改變是導(dǎo)致瘢痕疙瘩發(fā)生的重要原因[10-11]。目前治療瘢痕疙瘩的藥物研究也主要集中在抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡和減少細(xì)胞外基質(zhì)合成，促進(jìn)膠原降解方面[12]。此外，瘢痕組織中存在因血管閉塞等引起的血供不足及缺氧的微環(huán)境，可能是引起創(chuàng)傷過(guò)度愈合、皮膚纖維化增生形成瘢痕疙瘩的機(jī)制之一[13]。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中顯著升高且促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及活力，對(duì)瘢痕疙瘩的形成具有一定的促進(jìn)作用[8]。低氧微環(huán)境與瘢痕成纖維細(xì)胞異常增殖及膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑紊亂密切相關(guān)[14]。尋找低氧條件下能夠抵抗瘢痕疙瘩形成的藥物，對(duì)治療瘢痕特別是有可能由低氧微環(huán)境引起的瘢痕疙瘩具有重要的意義。

表1 低氧和常氧條件下不同濃度辛伐他汀對(duì)成纖維細(xì)胞存活率的影響 (xˉ±s，n=4)

辛伐他汀是一種臨床廣泛應(yīng)用的降脂藥，減少膽固醇生成，還具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用，對(duì)心血管疾病、類風(fēng)濕性疾病及各種器官纖維化疾病都具有保護(hù)作用。體外培養(yǎng)的系統(tǒng)性硬皮病成纖維細(xì)胞膠原合成增強(qiáng)，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄也明顯增加，而辛伐他汀能干擾轉(zhuǎn)錄因子與I型膠原基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，從而減少I型膠原基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成[15]。本文通過(guò)模擬體內(nèi)低氧病理微環(huán)境研究辛伐他汀對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及瘢痕生成因子表達(dá)的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低氧條件下，辛伐他汀能夠顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制HIF-1α、I型膠原和CTGF的合成，且辛伐他汀促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡與上調(diào)Bax、Caspase-3的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。研究表明，辛伐他汀能抑制低氧刺激的細(xì)胞增殖，促進(jìn)低氧下的血管形成[16-17]。低氧條件下，成纖維細(xì)胞HIF-1α表達(dá)增高，從而啟動(dòng)與血管形成相關(guān)因子的基因表達(dá)，促進(jìn)瘢痕生成[9]。辛伐他汀能明顯抑制兔耳增生性瘢痕部位CTGF的表達(dá)[6]，還可通過(guò)抑制CTGF的表達(dá)減輕大鼠炎癥性腸病腸纖維化進(jìn)展[18]。這些研究結(jié)論為本研究結(jié)果提供一定支持。

本次研究還發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀在低氧條件下能顯著增強(qiáng)TIMP-1表達(dá)。TIMP-1是基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)的主要抑制劑，主要調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲生長(zhǎng)及血管形成。研究證實(shí)MMP-9在瘢痕疙瘩中高表達(dá)，促進(jìn)瘢痕疙瘩向周圍浸潤(rùn)生長(zhǎng)[19]。TIMP-1表達(dá)上調(diào)可有效抑制MMP-9表達(dá)，從而抑制瘢痕疙瘩的侵襲及血管新生，后續(xù)將進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，辛伐他汀在低氧條件下可顯著抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的體外增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2、HIF-1α、Ⅰ型膠原及CTGF蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、Caspase-3及TIMP-1表達(dá)水平明顯升高，

[1]Li Y,Liu H,Liang Y,et al.DKK3 regulates cell proliferation, apoptosis and collagen synthesis in keloid fibroblasts via TGF-β1/Smad signaling pathway[J]. Biomed Pharmacother,2017,91:174-180.

[2]Kawarazaki A,Horinaka M,Yasuda S,et al.Sulforaphane suppresses cell growth and collagen expression of keloid fi broblasts[J].Wound Repair Regen,2017,25(2): 224-233.

[3]李周娜,朱蓮花,方宇輝,等.瘢痕疙瘩藥物治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2016, 30(2):196-199.

[4]Ghanim H,Green K,Abuaysheh S,et al.Ezetimibe and simvastatin combination inhibits and reverses the pro-inf l ammatory and proatherogenic effects of cream in obese patients[J].Atherosclerosis,2017,263:278-286.

[5]陳偉,謝劍鋒,何振華,等.辛伐他汀對(duì)鼠肺纖維化病理形態(tài)及血管新生的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2013,34(23):3554-3557.

[6]Ko JH,Kim PS,Zhao Y,et al.HMG-CoA reductase inhibitors (statins)reduce hypertrophic scar formation in a rabbit ear wounding model[J].Plast Reconstr Surg, 2012,129(2):252e-261e.

[7]陳秀華,楊建國(guó).辛伐他汀對(duì)人鼻息肉成纖維細(xì)胞增殖能力和膠原合成的影響[J].福建醫(yī)藥雜志,2014,36(1):63-65.

[8]胡強(qiáng),隋爽,王國(guó)棟.HIF-1α對(duì)病理性瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖活力的影響及機(jī)制[J].中國(guó)生化藥物雜志,2016,36(8):43-46.

[9]張哲,康春福,陳斌,等.缺氧狀態(tài)下瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)血管形成能力的影響[J].中華整形外科雜志,2014,30(4):283-288.

[10]李晉福,弓軍勝,梁鋼,等.慢病毒介導(dǎo) PPAR-γ基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞增殖,遷移和侵襲性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2016,25(7):42-46.

[11]郭雷洋,曹莫.瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2012,21(9):1674-1677.

[12]胡桓,鄭江紅.瘢痕疙瘩藥物治療的進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2017,23(9):1826-1829.

[13]康春福,陳斌,秦澤蓮,等.丹參酮ⅡA磺酸鈉在低氧下對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和促纖維化因子表達(dá)的影響[J].中國(guó)微創(chuàng)外科雜志,2015,15(7):649-654.

[14]Deschene K,Céleste C,Boerboom D,et al.Hypoxia regulates the expression of extracellular matrix associated proteins in equine dermal fi broblasts via HIF1[J]. J Dermatol Sci,2012,65(1):12-18.

[15]陳斌,康春福,于東寧,等.辛伐他汀對(duì)不同病理?xiàng)l件刺激的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能的影響[J].中華整形外科雜志,2016,32(2):130-135.

[16]Lv G,Li Y,Wang Z,et al.Hypoxia stimulates the proliferation of neonatal rat vascular smooth muscle cells through activation of hypoxia-inducible factor-1α[J]. Int J Clin Exp Med,2015,8(1):496-503.

[17]Li X,Liu X,Xu Y,et al.Expression prof i le of apoptotic and proliferative proteins in hypoxic HUVEC treated with statins[J].Int J Oncol,2015,46(2):677-684.

[18]梁美蘭,徐新寓,鞏堯瑤,等.辛伐他汀抑制大鼠炎癥性腸病結(jié)腸纖維化結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)[J].江蘇醫(yī)藥,2012,38(17):2018-2021.

[19]Li H,Nahas Z,Feng F,et al.Tissue engineering for in vitro analysis of matrix metalloproteinases in the pathogenesis of keloid lesions[J].JAMA Facial Plast Surg, 2013,15(6):448-456.