四六湯防治黃褐斑的藥效學(xué)作用分析

楊國峰，李增利，楊鈺華

(1.西安海棠職業(yè)學(xué)院 陜西 西安 710038；2.西安市第三中學(xué) 陜西 西安 710048)

黃褐斑是一種常見的色素增加性皮膚病，女性多發(fā)。臨床上除了常規(guī)西醫(yī)治療外，中醫(yī)療法也得到較多的應(yīng)用。近年來，中藥四六湯在黃褐斑的臨床治療中得到廣泛應(yīng)用[1]。但關(guān)于四六湯在黃褐斑治療過程中的具體藥效情況及其作用機(jī)制等研究，目前報(bào)道較少。為此，本研究通過建立動物模型的方式，從藥效學(xué)角度，對四六湯防治黃褐斑的相關(guān)作用機(jī)制分析研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料：豚鼠40只，均為雌性，健康狀況良好，體重（25±7）g，7周齡。均由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2011-0012。對于本次研究的具體內(nèi)容和研究形式、研究方法等，均向本醫(yī)院倫理學(xué)部門進(jìn)行匯報(bào)，接受審核，并經(jīng)批準(zhǔn)準(zhǔn)予實(shí)施。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案、使用動物品種品系規(guī)格、處死動物的方法、項(xiàng)目進(jìn)行中設(shè)計(jì)動物福利和倫理問題等均符合要求。四六湯，藥方中包含山藥25g，桃仁、當(dāng)歸、雞血藤、紅花、山茱萸、茯苓、白術(shù)、丹參各20g，澤瀉、柴胡、丹皮、甘草、白芍各15g，紫草、白芷、白蒺藜各10g，白僵蠶5g。藥材均購自本地藥房。對藥材進(jìn)行冷水浸泡后煎煮，對藥液進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，獲得濃度為1.44g/ml的藥液妥善保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)中以維生素C作為對照藥物，購自本地藥房。實(shí)驗(yàn)過程中使用的主要試劑和儀器情況見表1。

表1 主要試劑和儀器

1.2 方法

1.2.1 黃褐斑模型制備和實(shí)驗(yàn)分組：動物購買后均置于本院實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，待動物適應(yīng)環(huán)境之后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。對40只動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，隨機(jī)分為四組，每組10只，分別設(shè)為空白對照組、動物模型組、維生素C組、四六湯組。空白對照組不做任何處理，其他三組均在動物背部取3cm×3cm大小的皮膚進(jìn)行脫毛，并利用中波紫外線進(jìn)行照射，制備黃褐斑動物模型。紫外線波長設(shè)置為320nm，動物與光源之間的距離保持10cm左右。每只動物每次的照射時間為60min，每日照射1次，各組動物均實(shí)施連續(xù)4周的紫外線照射。照射過程中密切觀察各組豚鼠背部脫毛部位皮膚變化情況，如果肉眼觀察黑色素沉著面積擴(kuò)大、著色加深，局部皮膚出現(xiàn)明顯的黃褐斑，與黃褐斑的臨床表現(xiàn)一致，則視為動物模型制備成功（見圖1）。本次研究中，上述三組均成功制備黃褐斑動物模型，未出現(xiàn)死亡或失敗的情況。

1.2.2 分組處理：維生素C組、四六湯組分被給予維生素C注射液（批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H42020431，2010-09-30，湖北天圣康迪制藥有限公司生產(chǎn)）0.1g/kg注射和四六湯灌服治療。動物模型組不給予任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)；維生素C組、四六湯組均連續(xù)給藥4周。

圖1 動物造模前后局部皮膚

1.2.3 取材與相關(guān)指標(biāo)檢測：連續(xù)給藥4周對各組進(jìn)行尾部采血，之后對各組動物均實(shí)施背部脫毛，并在麻醉后予以斷頸處死，處死后快速獲得各組脫毛后皮膚組織送檢。取部分標(biāo)本檢測各組的性激素水平與SOD、MDA水平[2]。并取部分標(biāo)本切片后行HE染色，行組織病理學(xué)觀察，檢測各組皮損區(qū)黑素顆粒的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)一采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物SOD、MDA水平檢測與對比：實(shí)驗(yàn)動物均進(jìn)入最終的結(jié)果分析，未出現(xiàn)脫落和中途死亡的動物。空白對照組的SOD水平顯著高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）；四六湯組的SOD水平和MDA水平與空白對照組均存在一定差異，分別低于、高于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。且四六湯組的SOD水平明顯高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組(P＜0.05）。維生素C組的SOD、MDA水平與動物模型組之間也存在明顯差異(P＜0.05）,見表2。

表2 各組動物SOD、MDA 水平檢測對比 （xˉ±s,nmol/mg）

2.2 各組性激素水平檢測與比較：空白對照組的P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組，T水平顯著高于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）。四六湯組的各項(xiàng)指標(biāo)水平與空白對照組均存在一定差異，四六湯組的P、E2水平高于空白對照組，T水平低于空白對照組，但P＞0.05。且四六湯組的T水平明顯高于動物模型組與維生素C組，P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組（P＜0.05）。維生素C組的P、E2、T水平與動物模型組之間也存在明顯差異（P＜0.05），見表3。2.3 組織學(xué)結(jié)果：經(jīng)HE染色，動物模型組表皮增厚、表皮細(xì)胞大小呈不均勻增大。真皮層可見有局灶性炎性細(xì)胞浸潤。真皮及皮下組織微血管數(shù)目增生。黑色素細(xì)胞在HE染色標(biāo)本上不易辨認(rèn)。空白對照組上皮較薄，可看到分成四層，基底層和棘細(xì)胞層一起共2～3層，表面有少量角質(zhì)。真皮為染成淺紅色的膠原纖維束交織成網(wǎng)，可見毛囊、皮脂腺與表皮相連，真皮及真皮下可見少量血管（見圖2）。

表3 各組性激素水平檢測比較

表3 各組性激素水平檢測比較

注：＃表示與空白對照組比較，有顯著性差異，P＜0.05；※表示與四六湯組比較，有顯著性差異，P＜0.05；△表示與動物模型組比較，有顯著性差異，P＜0.05

組別 n P（ng/ml） E2（mol/ml） T（ng/ml）空白對照組動物模型組維生素C組四六湯組10 10 10 10 2.31±0.02 6.25±0.34＃※4.02±0.21＃※△2.82±0.03 550.12±12.03 851.32±15.37＃※687.15±16.75＃※△568.12±11.06 15.02±1.32 6.12±0.34＃※10.03±1.03＃※△14.16±1.21

圖2 動物皮膚的 HE 染色（×100）

3 討論

從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，黃褐斑屬于原因不明的色素沉著性疾病[3-4]。分析相關(guān)的發(fā)病原因，與多種因素相關(guān)，包括環(huán)境因素與遺傳因素以及精神因素、妊娠、內(nèi)分泌失調(diào)、氧自由基、濫用避孕藥等[5-6]。

中醫(yī)稱黃褐斑為“肝斑”、“黧黑斑”，并認(rèn)為屬于一種后天性黑色素沉著過度性皮膚病[7-8]。臨床治療中，四六湯的應(yīng)用較多，方中包含桃仁、山藥、當(dāng)歸、紅花、山茱萸、澤瀉、白芍等多種中藥，共同應(yīng)用，可以滋養(yǎng)肌膚，祛除濁滯，化瘀祛斑[9]。另外，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，四六湯具有一定的抗氧化作用，進(jìn)而能夠獲得理想的祛斑效果。本研究從藥效學(xué)角度分析其祛斑機(jī)制，抗氧化作用與黃褐斑的形成存在密切聯(lián)系，氧自由基與皮膚黑色素的形成及色素沉著有關(guān)，正常情況下，機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化酶系統(tǒng)保持著動態(tài)平衡。SOD屬于抗氧化劑，與黑素的產(chǎn)生之間存在一定關(guān)系，受到一定因素的影響，其水平會發(fā)生變化，代謝失衡導(dǎo)致黑素生成過多，進(jìn)而引發(fā)黃褐斑。而提高機(jī)體內(nèi)SOD水平，可以有效清除各種多余的超氧自由基，如MDA，進(jìn)而其形成量顯著減少，從而阻止黃褐斑的產(chǎn)生[10]。研究結(jié)果顯示，對各組動物的SOD、MDA水平進(jìn)行檢測和比較，空白對照組的SOD水平顯著高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組。四六湯組的SOD水平低于空白對照組，MDA水平高于空白對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且四六湯組的SOD水平明顯高于動物模型組與維生素C組，MDA水平顯著低于動物模型組與維生素C組，P＜0.05。維生素C組的SOD、MDA水平與動物模型組之間也存在明顯差異，P＜0.05。血液及皮膚組織中SOD降低MDA的含量，使體內(nèi)過氧化程度降低，抗氧化能力及清除自由基能力增強(qiáng)，減少黑素細(xì)胞的生成及皮膚色素沉著[11-12]。四六湯對紫外線照射所致動物黃褐斑模型具有一定的保護(hù)和改善作用，分析其藥效學(xué)作用，可能與有效抗氧化有關(guān)[13]。另外，黃褐斑的出現(xiàn)與機(jī)體內(nèi)性激素水平之間存在十分密切的聯(lián)系。黑色素的產(chǎn)生會受到人體內(nèi)性激素水平的較大影響，對女性而言，在一些特殊的生理階段，包括妊娠期和月經(jīng)期，體內(nèi)的性激素水平會出現(xiàn)明顯的改變，進(jìn)而影響到黑素的產(chǎn)生。在人體內(nèi)分泌不穩(wěn)定時通常引起情緒不穩(wěn)定，也會間接引起色斑形成。女性黃褐斑的形成與性激素的異常存在一定相關(guān)性[14]，患者血清的FSH、E2、P水平會出現(xiàn)顯著上升的情況。本次研究中，空白對照組的P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組，T水平顯著高于動物模型組與維生素C組。四六湯組的P、E2水平高于空白對照組，T水平低于空白對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。且四六湯組的T水平明顯高于動物模型組與維生素C組，P、E2水平顯著低于動物模型組與維生素C組。維生素C組的P、E2、T水平與動物模型組間也存在明顯差異。即證實(shí)，通過治療黃褐斑動物體內(nèi)的性激素水平發(fā)生了異常變化，而四六湯治療可顯著改善其體內(nèi)的性激素水平且效果更為明顯，可以更好地改善紫外線照射所致黃褐斑動物模型[15]。

綜上所述，通過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，四六湯對紫外線照射所致動物黃褐斑模型具有一定的保護(hù)和改善作用，分析其藥效學(xué)作用，可能與有效抗氧化，并改善動物體內(nèi)性激素水平有關(guān)。進(jìn)一步的結(jié)果還有待今后深入研究。

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