丹參對大鼠皮膚創(chuàng)傷修復及血管內(nèi)皮生長因子表達的影響

盧尚兵，金 昊，趙鑫鑫，朱 玲，李俊岑，曾 茜，李 龍，康春雨

(1.米蘭柏羽醫(yī)學美容醫(yī)院美容整形外科 四川 成都 610041；2.成都醫(yī)學院實驗技術(shù)教研室 四川 成都 610081)

皮膚創(chuàng)傷后修復過程復雜，大致經(jīng)歷以下三個階段：①止血和炎癥反應階段；②細胞增殖分化階段；③組織重建或瘢痕形成階段[1]。如何縮短愈合周期，減少感染發(fā)生，是臨床外科醫(yī)生所面臨的難題。據(jù)文獻報道[2]：丹參是皮膚愈合，創(chuàng)傷修復的良藥，但其中的分子機制尚待闡明。本文通過建立大鼠皮膚創(chuàng)傷修復模型，探討丹參對傷口愈合的作用以及對創(chuàng)傷后血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達的影響，為進一步闡明其潛在的修復分子機制提供實驗依據(jù)，也為臨床治療皮膚創(chuàng)傷提供新的思維。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：取3月齡SD品系大鼠36只，雌雄不限，體重200～220g，平均(200±20)g，由四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-15。

1.2 藥品和試劑：丹參注射液（國藥準字Z51021303，5支/盒，四川升和藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)）置冰箱4℃保存；免疫組化所用一抗：VEGF Antibody(貨號BA0407)，效價1:200，抗體來源為兔，購自Boster Biological Technology；二抗：購自中杉金橋的SP-9001兔SP檢測試劑盒，批號：17173A02；B液：生物素化山羊抗兔二抗工作液；C液：辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。

1.3 實驗儀器：智能程控生物組織自動脫水機：TC-120（泰維科技生產(chǎn)）；生物組織自動包埋機：TB-718（泰維科技生產(chǎn)）；輪轉(zhuǎn)切片機：RM2235（Leica BiosystemsNusslochGmbh生產(chǎn)）；電腦生物組織攤烤片機：KD-T（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：HROP-80AB，青島海爾特種電冰柜有限公司生產(chǎn)）；生物顯微鏡（型號：BA210，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司生產(chǎn)）。均由成都醫(yī)學院實驗技術(shù)教研室提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 創(chuàng)傷模型制備：36只3月齡SD大鼠，隨機分為丹參組和對照組。將所有SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周，實驗前1d脫毛，稱重；用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉(劑量：1ml/kg) ，固定大鼠于手術(shù)臺上，常規(guī)消毒；在距脊柱0.5cm處，用刀將1.5cm×1.5cm范圍內(nèi)的皮膚切除，但不傷及脊柱旁肌肉上的脂肪及筋膜，簡單包扎后待后續(xù)處理。

1.4.2 創(chuàng)傷修復：造模成功后，大鼠單籠飼養(yǎng)。術(shù)后1h開始用藥，丹參組用丹參注射液噴灑創(chuàng)面（劑量：1ml/只），對照組用相同劑量的生理鹽水噴灑創(chuàng)面。各組每日09:00、18:00各噴1次，持續(xù)1周，給予標準飼料喂養(yǎng)，供給清潔水，動物飼養(yǎng)室溫維持在25℃～30℃，鼠籠每隔2d重換墊料。

1.4.3 組織取材：按術(shù)后1d、3d、7d時間點取材，取材前行3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取距離創(chuàng)緣8mm以內(nèi)的皮膚全層組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.4.4 HE染色和免疫組織化學染色（immunohistochemistry staining, IHC）：標本用4%多聚甲醛固定后制作5μm厚的石蠟切片。每例標本間隔取石蠟切片20張，入60℃烤箱30min，梯度酒精水化，一部分常規(guī)HE染色，另一部分高壓熱抗原修復，非生物素二步法進行VEGF免疫組化染色：用3% H2O2預處理10min，封閉內(nèi)源性過氧化酶，用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用正常山羊血清在37℃溫箱中封閉非特異性抗原10min。用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用VEGF抗體（效價1:200）孵育切片，入冰箱（4℃）過夜，用0.01mol/L PBS漂洗3次，每次2min。用羊抗兔二抗37℃恒溫孵育30min，用PBS洗3次，每次2min；把切片入DAB-H?2O2顯色液，室溫下反應，待顯色充分，及時用0.01mol/L PBS漂洗2次，每次2min；蘇木素復染，梯度灑精逐級脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.5 陰性對照實驗：用PBS代VEGF抗體，其余步驟不變。

1.4.6 觀察指標

1.4.6.1 未愈面積的測量：造模成功后，采用OLYMPUS數(shù)碼照像機采集每只動物造模后1d、3d、7d的未愈面積圖像，然后利用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件( Mdia Cybernetics公司，美國)測量面積, 并記錄。

1.4.6.2 平均光密度值（MD）測定：將各組免疫組化切片置于光學顯微鏡下，采用OLYMPUS數(shù)碼照像機采集圖像進行觀察分析。在400倍下從每張切片中各隨機選擇5個視野進行拍照。然后用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件對染色陽性的細胞進行光密度分析，測量陽性細胞的平均光密度值。

1.5 統(tǒng)計學分析：各組未愈合面積和平均光密度值數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，用SPSS20.0軟件包，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)比較采用方差分析LSD 法。

2 結(jié)果

2.1 兩組創(chuàng)傷未愈面積測量結(jié)果：損傷后1d、3d、7d對照組和丹參組大鼠創(chuàng)傷皮膚未愈合面積均逐漸縮小，3d、7d丹參組未愈合面積均小于對照組(P＜0.05)。見圖1，表1。

圖1 兩組創(chuàng)傷皮膚未愈合創(chuàng)面

表1 兩組創(chuàng)傷后不同時間段未愈合面積測量結(jié)果

表1 兩組創(chuàng)傷后不同時間段未愈合面積測量結(jié)果

注：*表示與對照組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) 未愈合面積（mm2）1d 3d 7d丹參組 18 131.85±11.451 82.38±3.392* 4.02±0.217*對照組 18 138.61±3.637 132.85±1.321 14.21±1.617

2.2 HE染色結(jié)果：損傷后1d，丹參組和對照組鏡下均可見真皮層毛細血管擴張充血，大量紅細胞散布于組織間隙，小血管內(nèi)紅細胞淤積形成血栓，損傷周圍見少量中性粒細胞浸潤，表皮層可見少量炎性細胞浸潤。見圖2A、D。

損傷后3d，大量肉芽組織形成并向創(chuàng)口生長。各組真皮層和表皮層均可見明顯擴張的毛細血管，損傷區(qū)周圍可見毛細血管生成，大量中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，除炎癥細胞外，尚可見大量成纖維細胞。丹參組小血管內(nèi)紅細胞淤積情況較對照組輕，新生毛細血管數(shù)量較對照組多。見圖2B、E。

損傷后7d，各組創(chuàng)口已基本為肉芽組織填平，創(chuàng)口基本愈合。成纖維細胞大量增殖，分泌膠原蛋白。肉芽組織纖維化，向瘢痕組織轉(zhuǎn)變。損傷區(qū)周圍炎性細胞少見。見圖2C、F。

圖2 兩組創(chuàng)傷皮膚組織HE染色結(jié)果

2.3 免疫組化染色結(jié)果

2.3.1 損傷邊緣皮膚內(nèi)VEGF免疫陽性反應物的分布概況：在本實驗中觀察到VEGF在動物皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、毛囊、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中有表達，但以成纖維細胞的表達為主，陽性反應物主要定位在胞核、胞漿和基質(zhì)中。

2.3.2 皮膚創(chuàng)傷后VEGF的變化情況：損傷后1d，各組皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、成纖維細胞的胞漿內(nèi)可見VEGF免疫反應陽性物。在浸潤的中性粒細胞中少數(shù)細胞胞漿中呈VEGF陽性染色，在擴張的血管內(nèi)皮細胞中也可見VEGF陽性表達。經(jīng)平均光密度值測定，丹參組VEGF表達強度高于對照組(P＜0.05)。見圖3A、D。

損傷后3d，損傷區(qū)成纖維細胞大量增殖，炎癥細胞浸潤，VEGF在表皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞的胞漿表達增強，表達強度明顯高于損傷后1d(P＜0.05)。丹參組VEGF表達強度仍高于對照組(P＜0.05)。見圖3B、E。

損傷后7d，各組皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、成纖維細胞的胞漿內(nèi)VEGF免疫反應陽性物減弱，較損傷后3d比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。丹參組VEGF表達強度與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見圖3C、F。見表2。

免疫組織化學方法對照實驗結(jié)果均為陰性。

圖3 兩組創(chuàng)傷皮膚組織免疫組織化學染色結(jié)果(400×)

表2 兩組VEGF免疫反應陽性物平均光密度值

表2 兩組VEGF免疫反應陽性物平均光密度值

注：*表示與對照組比較，P＜0.05；#表示組內(nèi)比較，P＜0.05

組別 例數(shù) 平均光密度值1d 3d 7d丹參組 18 0.21±0.003* 0.36±0.056*,# 0.19±0.042#對照組 18 0.17±0.015 0.23±0.011# 0.18±0.009#

3 討論

3.1 丹參對大鼠皮膚創(chuàng)傷修復的促進作用：丹參為唇形科多年生草木植物，是中醫(yī)活血化瘀的代表性藥物。大量臨床實踐證明，丹參可通過促進微循環(huán)、免疫調(diào)節(jié)、抑制過再生、減輕組織缺血-再灌注損傷、促進創(chuàng)傷組織再生、抑制炎癥反應及細胞凋亡等多個方面促進創(chuàng)傷組織修復[2]。本次研究中大鼠在皮膚創(chuàng)傷后不同時間點，對照組和丹參組的未愈皮膚面積均逐漸縮小，3d、7d丹參組未愈合面積均小于對照組（P＜0.05），表明丹參對大鼠皮膚創(chuàng)傷修復有促進作用。組織病理學結(jié)果顯示：損傷后1d，丹參組和對照組鏡下均可見真皮層毛細血管擴張充血，血管內(nèi)有血栓形成，損傷周圍有炎性細胞浸潤，此時處于止血和炎癥反應階段。損傷后3d，大量肉芽組織形成并向創(chuàng)口生長，進入細胞增殖和分化階段，兩組損傷區(qū)域周圍均可見新生毛細血管及大量成纖維細胞，且丹參組小血管內(nèi)紅細胞淤積程度較對照組輕，新生毛細血管數(shù)量較對照組多，表明丹參不僅可減少修復損傷過程中的血栓形成，還能通過促進毛細血管增生，加速創(chuàng)傷組織修復。損傷后7d，進入組織重建或瘢痕形成階段，創(chuàng)口已基本為肉芽組織填平，成纖維細胞大量增殖，并分泌膠原蛋白；肉芽組織纖維化，向瘢痕組織轉(zhuǎn)變，此階段丹參組與對照組組織病理學改變相似。

目前認為丹參對血管新生的調(diào)節(jié)作用呈雙向性[3]，Bian W等[4]研究發(fā)現(xiàn)丹參的活性成分二氫丹參酮Ⅰ可抑制毛細血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，從而抑制血管生成。因此，其對腫瘤細胞有毒性作用。Luo Y等[5]研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮能通過抑制VEGFR-3 而調(diào)停細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶磷酸化，從而抑制淋巴內(nèi)皮細胞的血管形成。然而，在劉暖[6]、張淑娟[7]等關(guān)于心肌梗死的研究中發(fā)現(xiàn)丹參提取物可以促進大鼠心肌梗死后心肌組織血管新生，并且在其他心腦血管疾病研究中也有類似的實驗結(jié)果[8-9]。因此，丹參在不同的疾病或組織中，對血管新生具有不同的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：在細胞增殖和分化階段，丹參可促進創(chuàng)傷皮膚真皮層及表皮層的毛細血管增生，加速損傷修復。

3.2 丹參上調(diào)VEGF的表達水平促進創(chuàng)傷修復：VEGF是一種對血管生成有極強誘導作用的多功能誘導因子，能特異性作用于血管內(nèi)皮細胞，具有促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖、細胞質(zhì)鈣聚集以及誘導血管生成、使血管通透性增強等作用，是已知促血管生成所有因子中的最強因子[10-12]。研究顯示，其在心腦血管疾病、腎臟疾病、創(chuàng)傷修復及腫瘤的形成中均有重要作用[13-14]。本實驗通過免疫組織化學染色方法對損傷邊緣皮膚內(nèi)VEGF免疫陽性反應物的分布進行觀察，并對VEGF陽性反應物進行了光密度檢測，以實現(xiàn)對其表達水平的半定量分析。結(jié)果顯示：VEGF在大鼠皮膚表皮細胞、皮脂腺上皮細胞、毛囊、中性粒細胞、巨噬細胞、成纖維細胞中均有表達，但以成纖維細胞的表達為主。目前研究表明，正常皮膚表皮中有少量 VEGF存在，具有維持自身穩(wěn)態(tài)的作用[15-16]。Corral 等[17]研究發(fā)現(xiàn)VEGF mRNA 在皮膚損傷后表達可提高 6～7倍，可持續(xù)至傷后10d，提出VEGF在局部創(chuàng)傷修復中的作用超過了堿性成纖維細胞轉(zhuǎn)化因子。因此，VEGF在皮膚損傷修復中起有益作用。

相關(guān)文獻報道[18]，皮膚損傷后，隨炎性細胞的趨化、滲出，VEGF在表皮及毛囊上皮細胞的表達逐漸減弱，而在中性粒細胞、巨噬細胞及成纖維細胞的表達逐漸增加，巨噬細胞等炎性細胞產(chǎn)生VEGF，TGF-β等多種細胞因子參與創(chuàng)傷的愈合過程。本研究結(jié)果顯示：3d、7d后成纖維細胞的胞漿內(nèi)可見VEGF免疫反應陽性物，明顯多于傷后1d；經(jīng)平均光密度值測定，1d、3d后丹參組VEGF表達強度高于對照組，而7d后丹參組VEGF表達強度與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義。提示丹參可增加創(chuàng)傷修復過程中止血和炎癥反應階段和細胞增殖分化階段VEGF的表達水平。目前，國內(nèi)外已有大量研究表明丹參可以調(diào)節(jié)VEGF的表達。高麗等[19]提出丹參酮ⅡA可通過抑制VEGF的表達抑制乳腺癌細胞株MDAMB-231的體外血管生成擬態(tài)的形成和細胞增殖。周利紅等[20-21]研究也證實，丹參酮ⅡA能夠通過抑制VEGF的表達從而明顯抑制小鼠腸癌皮下移植瘤內(nèi)血管新生。而Wang W等[22]研究證明丹參酮ⅡA可抑制 VEGFR-1影響腫瘤血管內(nèi)皮細胞(TECs)的血管形成功能。以上研究均表明丹參的活性物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)VEGF的表達水平，結(jié)合本實驗結(jié)果，筆者認為丹參可通過上調(diào)VEGF的表達水平促進皮膚創(chuàng)傷修復。此外，也有研究提出隱丹參酮能夠通過影響TGF-β1、b-FGF、bax、bcl-2、NF-kB等多種細胞因子誘導平滑肌細胞增殖、遷移及血管生成[3,23-24]。因此，丹參對損傷修復的作用機制并不是通過單一因子的調(diào)節(jié)，而是一個復雜的分子網(wǎng)絡(luò)，值得進一步深入探索。

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