甘草酸對(duì)UVB誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響

傅 云，廖 建，張 瓊，王冬梅，王業(yè)秋，李建民，張麗宏

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 黑龍江 哈爾濱 150040；2.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 四川 成都 610041；3.內(nèi)江市中醫(yī)醫(yī)院 四川 內(nèi)江 641000）

近年來，隨著工業(yè)化生產(chǎn)的快速發(fā)展，環(huán)境污染日益加重，臭氧層阻擋紫外線（ultraviolet, UV）的能力減弱，輻射至地球表面的UV逐漸增多[1]。中波紫外線（UVB）波長(zhǎng)為290～320nm，長(zhǎng)時(shí)間接受過度的UVB輻射將導(dǎo)致皮膚光損傷，引發(fā)一系列形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及生理學(xué)轉(zhuǎn)化[2-3]，導(dǎo)致皮膚皺縮、無彈性、無光澤，嚴(yán)重可致色素沉著及惡性腫瘤發(fā)生[4]。長(zhǎng)期的UVB輻射引起的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、DNA損傷和細(xì)胞凋亡等是直接導(dǎo)致皮膚光老化的重要機(jī)制[5]，同時(shí)UVB輻射導(dǎo)致大量活性氧自由基（ROS）堆積于體內(nèi)，可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。UVB主要影響人體皮膚表皮細(xì)胞，表皮細(xì)胞大部分由角質(zhì)形成細(xì)胞（human keratinocytes, HaCaT）組成[7]。研究表明[8]，當(dāng)UVB照射劑量為30mJ/cm2時(shí)，即可導(dǎo)致人皮膚HaCaT細(xì)胞光損傷，并且發(fā)生凋亡和壞死。甘草酸是甘草根部提取物中含量較高的重要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫、抑制黑色素沉著、抗癌等功效[9]。此外，甘草酸還具有一定的光熱穩(wěn)定性，可減輕紫外線輻射造成的皮膚光損傷[10]。目前，對(duì)于甘草酸通過自身抗氧化、抗炎等藥理作用保護(hù)皮膚光老化的研究較多，而對(duì)于甘草酸能否抑制UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞凋亡及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用總劑量為30mJ/cm2的UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡，用不同濃度的甘草酸作用于HaCaT細(xì)胞，探討甘草酸對(duì)UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株：人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）（上海中喬新舟有限公司，批號(hào)ZQ0044）。

1.2 藥物和試劑：甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16081812）；Annexin-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170524）；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒（生工生物工程有限公司，批號(hào)B532445）；SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX)（生工生物工程有限公司，B532956）；羊抗兔二抗（博士德生物有限公司，批號(hào)BA1054）；兔抗人β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體，兔抗人Caspase-3、Caspase-9多克隆抗體（博奧森生物有限公司，批號(hào)分別為bs-0081R，bs-0049R）。

1.3 儀器：HF240型CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；MK3型酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）；HPC-150型流式細(xì)胞儀（Handyem公司）；GTR16-2型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；mini PROTEAN Tetra Cell型電泳儀，Trans-Blot SD Cell型半干轉(zhuǎn)膜儀（英國(guó)Bio-Rad公司）；Smart chemi Ⅱ型一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司）；Nano-100型微量分光光度計(jì)（杭州奧勝儀器有限公司）；Mx3 000P型實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀（安捷倫科技有限公司）。

2 方法

2.1 甘草酸有效安全濃度的篩選：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT），胰酶消化，離心，計(jì)數(shù)，以濃度為1×104個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種至96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，96孔板的四周用PBS封閉，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。96孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為空白組和甘草酸組。吸棄培養(yǎng)液，空白組加入200μl新培養(yǎng)液；甘草酸組分別加入（1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，1×10-10）mol/L甘草酸，200 μl/孔。培養(yǎng)24h后，加入5g/L MTT，20μl/孔，孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），150μl/孔，于37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10min，在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD）。

2.2 MTT法測(cè)定HaCaT增殖率：96孔板內(nèi)細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、UVB組、甘草酸+UVB組。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，每孔加200μl PBS，使用鋁箔紙將空白組覆蓋，用30mJ/cm2UVB照射UVB組和甘草酸+UVB組，根據(jù)公式：照射劑量（mJ/cm2)=照射強(qiáng)度（mW/cm2)×照射時(shí)間(s)，輻射強(qiáng)度為0.5mW/cm2，計(jì)算出照射時(shí)間為60s。照射完畢，棄去PBS，甘草酸+UVB組分別加入1×10-7，1×10-6，1×10-5mol/L甘草酸，200μl/孔，UVB組和空白組加入DMEM培養(yǎng)液，200μl/孔，培養(yǎng)24h，加入MTT，20μl/孔，孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO，150μl/孔，37℃恒溫培養(yǎng)震蕩器上震蕩10min，在酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值（OD）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，胰酶消化，離心，計(jì)數(shù)，以濃度為1×106個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種至6孔板。6孔板內(nèi)細(xì)胞參照2.2方式進(jìn)行分組和造模。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，收集6孔板中各組細(xì)胞，將舊培養(yǎng)液吸取至15ml離心管中，使用PBS清洗細(xì)胞2次，加入胰蛋白酶進(jìn)行消化，再加入舊培養(yǎng)液終止消化，1 000rpm，離心5min，棄上清，加入3ml PBS重懸，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，取4～12萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，置于1.5ml離心管中，1 000rpm，離心5min，棄上清。按照試劑盒說明書操作，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用Flowjo軟件處理。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-PCR）法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平：待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，收集6孔板中各組細(xì)胞，每管細(xì)胞中加入1ml細(xì)胞裂解液（Trizol），室溫下靜止10min，用移液槍吹打5min，使細(xì)胞完全破碎，轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中。每個(gè)EP管對(duì)應(yīng)加入0.2ml氯仿，劇烈晃動(dòng)15s，室溫靜置3min，4℃，13 200rpm，離心15min。將上層液體提取約400μl至EP管中，每管加入等體積的異丙醇，上下顛倒使混勻，-20℃過夜。-20℃取出后，4℃，12 000rpm離心10min，EP管底部有少許的白色物質(zhì)，即為總RNA，棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇，移液槍吹打洗滌RNA，4℃，10 500rpm離心5min，倒扣控干液體10min，加入20μl無RNA酶水溶解RNA。用Nano-100微量分光光度計(jì)測(cè)總RNA的濃度及純度，取A260/A280吸光度比值在1.8～2.0之間得樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。20μl體系[MLtraSYBR Mixture(2×) 10μl，正向和反向引物各0.4μl，ddH2O 8.4μl，cDNA 0.8μl]進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 3min（預(yù)變性），95℃ 20s（變性），72℃ 20s（退火/延伸），40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增程序中讀取不同組的Ct值，按照2-△△Ct分析法，公式為：??Ct=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）給藥組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，計(jì)算出各組mRNA的相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列信息

2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平：待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)，收集6孔板中各組細(xì)胞，裂解液（RIPA）和蛋白酶抑制劑（PMSF）以99:1的比例混勻，以100μl/孔的量加入混合液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品和上樣緩沖液以4:1的比例混勻，加熱煮沸10min。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）80V，30min，更換電壓110V，60min。半干轉(zhuǎn)膜30min，室溫封閉2h，用封閉液以1:500的比例稀釋一抗，4℃過夜，TBST洗膜4次，加二抗（1:10 000稀釋），置于水平搖床上孵育2h，TBST洗膜4次，加入ECL發(fā)光液（A液和B液按1:1的比例配制），使用發(fā)光成像儀拍攝，利用Lane ID凝膠軟件分析各條帶的灰度值，以目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值的比值，反映目的蛋白表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，組間比較采用ANOVA方差分析，多組間比較采用LSD、SNK法檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘草酸對(duì)正常HaCaT細(xì)胞增殖率的影響：與空白組比較，1×10-8、1×10-9、1×10-10mol/L甘草酸可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖（P＜0.01）；1×10-3、1×10-4mol/L甘草酸可明顯抑制細(xì)胞增殖（P＜0.01）；1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸組細(xì)胞增殖率與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），對(duì)細(xì)胞無明顯的促進(jìn)及抑制作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10-7、10-6、10-5mol/L甘草酸用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。見表2。

表2 甘草酸對(duì)正常HaCaT細(xì)胞增殖率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.2 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞增殖率的影響：與空白組比較，UVB組細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞增殖率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.3 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞總凋亡率的影響：與空白組比較，UVB組細(xì)胞總凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組細(xì)胞總凋亡率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞總凋亡率的影響 （xˉ±s，n=6）

3.4 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響：與空白組比較，UVB組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表5、圖1。

表5 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響

圖1 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)水平的影響

3.5 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響：與空白組比較，UVB組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與UVB組比較，1×10-5、1×10-6、1×10-7mol/L甘草酸+UVB組Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表6、圖2。

表6 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9 蛋白表達(dá)水平的影響

圖2 甘草酸對(duì)光老化HaCaT細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平的影響

4 討論

生物體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，不僅需要依賴細(xì)胞的增殖、分化，細(xì)胞的凋亡也起著關(guān)鍵作用[11]。正常的細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)發(fā)起以便更好維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過程[12]。UVB輻射至人體皮膚，因其穿透力較淺，因此主要作用于表皮內(nèi)的色基，可使組織受到損傷，導(dǎo)致明顯的人皮膚角質(zhì)細(xì)胞（曬傷細(xì)胞）凋亡[13]。細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，可分為凋亡激活信號(hào)、啟動(dòng)、承諾、執(zhí)行和清除五個(gè)步驟[14]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族對(duì)細(xì)胞凋亡起著關(guān)鍵作用，正常情況下Caspase是以無活性的酶原形式存在，在受到外界刺激時(shí)，發(fā)生水解被激活，引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)[15]。目前研究認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要由兩條信號(hào)通路介導(dǎo)，即Fas/FasL及TNF/TNFR通路和線粒體通路，而這兩條通路的激活最后都需要活化Caspase完成凋亡并在Caspase-3處匯合[16]。Caspase-3被稱為細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”，處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中下游，是凋亡執(zhí)行因子以及凋亡途徑的匯聚點(diǎn)[17]。UVB作為凋亡刺激因素作用于細(xì)胞后，誘使活性氧（ROS）的產(chǎn)生，通過MAPK等信號(hào)通路可向下刺激Caspase-3，活化后的Caspase-3作用于細(xì)胞核內(nèi)的DNA，在PARP-1等效應(yīng)蛋白的協(xié)同作用下，使染色體固縮，并伴隨著DNA片段化及凋亡小體形成等，引發(fā)細(xì)胞調(diào)亡[18]。Caspase-9 則被稱之為細(xì)胞凋亡的“發(fā)起者”，活化的Caspase-9可激活Caspase-3，活化的Caspase-3可特異性的水解細(xì)胞內(nèi)各種底物，從而引發(fā) Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞形成典型的凋亡小體，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。線粒體受到外界凋亡信號(hào)刺激后，促使細(xì)胞色素C由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，Caspase-9可與細(xì)胞色素C以及Apaf-1結(jié)合形成活性復(fù)合體，進(jìn)一步啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的效應(yīng)組成員 Caspase-3、Caspase-6等，最終激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB輻射后，細(xì)胞總凋亡率顯著升高，Caspase-3、Caspase-9 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示UVB輻射可激活 Caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，可促進(jìn)凋亡因子Caspase-3 及Caspase-9的表達(dá)。加入甘草酸藥物干預(yù)后，細(xì)胞總凋亡率顯著降低，Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示甘草酸可降低Caspase-3、Caspase-9的表達(dá)水平，進(jìn)一步抑制UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，甘草酸可通過降低細(xì)胞的總凋亡率，減少Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白的表達(dá)，從而抑制UVB輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于甘草酸能否通過調(diào)控其他凋亡相關(guān)通路或凋亡因子的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，有待進(jìn)一步研究。

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